1. Digestão de tumores pancreáticos
- Coloque o tumor pancreático dissecado, tumores de local metastático ou tecido pancreático saudável em PBS gelado e armazene no gelo.
- Use uma pinça para transferir o tumor para uma placa de Petri.
- Adicione 5,0 mL de meio de digestão (2 mg/mL de colagenase, 0,025 mg/mL de DNase RPMI) em um tubo de 50 mL; armazene no gelo para evitar o início da atividade enzimática.
nota: Este protocolo utiliza a colagenase tipo V, que tem uma atividade de ≥1 unidades/mg FALGPA e > 125 unidades de digestão de colágeno (CDU)/mg sólido. As alíquotas de colagenase e DNase podem ser armazenadas a -20 °C e descongeladas em gelo antes do uso. Quando ambos são completamente solubilizados em RPMI estéril, eles podem ser passados por um filtro de 0,2 μm para remover contaminantes. A colagenase deve ser completamente solubilizada antes da filtragem para evitar perda de material.
- Pegue uma pequena alíquota desta solução para cobrir o tumor na placa de Petri.
- Use bisturi estéril e fórceps para cortar o tumor em pedaços pequenos, com aproximadamente menos de 3 mm de comprimento.
- Raspe os pedaços do tumor no tubo e inverta suavemente o tubo até que todos os pedaços estejam submersos no meio de digestão. Armazene no gelo se outras amostras de tumor precisarem ser preparadas em lote.
- Transfira para um dispositivo de agitação por 20 min a 37 ° C. Certifique-se de que todos os pedaços do tumor estejam submersos e não grudados na borda do tubo. Se não for possível agitar, então vórtice a amostra a cada 5 minutos para ajudar na digestão.
2. Preparação de suspensão unicelular do tumor digerido
- Imediatamente após a etapa de digestão, coloque o tubo no gelo para diminuir a atividade enzimática.
- Adicione EDTA para atingir uma concentração final de 20 mM e uma breve amostra de vórtice para misturar. Isso diminuirá ainda mais a atividade enzimática.
- Abra o tubo e enxágue qualquer digestão do tumor da tampa do tubo com meio RPMI fresco.
- Prepare um filtro de 70 μm (o tamanho do μm do filtro pode ser alterado conforme desejado) em um tubo aberto de 50 mL, no gelo.
- Molhe previamente o filtro com meio.
- Ressuspenda as células digeridas e lave as laterais do tubo usando uma tira de 25 mL ou maior. A abertura mais larga da faixa é importante para permitir que o digestor espesso passe facilmente.
- Transfira todo o digerido, usando a tira de 25 mL, para a peneira.
- Amasse o tumor em cima do filtro usando um êmbolo de seringa de 1 mL. Amasse apenas diretamente para cima e para baixo para minimizar a tensão de cisalhamento nas células.
- Lave continuamente as células através do filtro com RPMI. Certifique-se de lavar com força suficiente para empurrar as células.
- Se ainda houver material para triturar, mas o RPMI parar de passar, o filtro ficará saturado. Portanto, transfira a amostra para um novo filtro e continue.
nota: Eventualmente, apenas os componentes da matriz extracelular permanecerão no filtro, todas as células individuais devem ter passado.
- Centrifugue o tubo durante 5 min a 300 x g e 4 °C.
- Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular em RPMI completo e passe diretamente por outro filtro para remover qualquer matriz extracelular ou aglomerados de células grandes que não possam ser ressuspensos adequadamente.
- Neste ponto, se não for necessária qualquer estimulação, corar imediatamente as células isoladas para análise por citometria de fluxo, saltando para centrifugar a placa durante 5 minutos a 300 x g e 4 °C. Remover o sobrenadante sacudindo a placa de cabeça para baixo com um movimento brusco. Alternativamente, ressuspendê-los em meio de congelamento (10% DMSO em FBS) e armazená-los a -80 °C, seguido de armazenamento de longo prazo em nitrogênio líquido.
nota: A etapa de congelamento pode permitir a purificação das células imunológicas em uma data posterior; no entanto, a quantificação de subconjuntos de células imunes pode exigir otimização para confirmar que o número de células e o fenótipo não são afetados pelo processo de congelamento/descongelamento. A estimulação ex vivo de células T é melhor realizada em amostras de tumores frescos. Neste ponto, a amostra pode ser purificada por remoção de células mortas à base de esferas ou ensaios de enriquecimento de células imunes, se necessário.
3. Preparando células para estimulação ex vivo
- Contar as células até atingir uma concentração de 2 x 106/100 μL em meio completo (RPMI 10% FBS, 1X penicilina e 1X estreptomicina).
nota: O alto número de células totais plaqueadas garante que haverá células T adequadas nesta amostra para análise. No entanto, o número pode ser aumentado ou diminuído, dependendo da disponibilidade da amostra e da natureza rara dos subconjuntos de células T de interesse.
- Placa de 100 μL de células em uma placa de 96 poços com fundo em U.
- Adicionar 100 μL de meio completo contendo uma preparação 2x de PMA/ionomicina (para atingir uma concentração final de 0,081 μM e 1,34 μM, respectivamente, conforme recomendado pelo fabricante).
nota: Se medir a degranulação / exocitose, inclua também aqui um anti-camundongo conjugado fluorescentemente CD107a na mídia. Uma amostra de controle que não contém CD107a também deve ser realizada.
- Colocar em estufa a 37 °C com 5% de CO2 durante 1 h.
- Adicionar 20 μL de uma preparação 10x de brefeldina A e monensina (para atingir uma concentração final de 1,06 μM e 2,0 μM, respectivamente (conforme recomendado pelo fabricante) em meio completo.
nota: Brefeldina A e monensina são inibidores do transporte de proteínas e, portanto, bloqueiam a liberação extracelular de citocinas, etc., permitindo sua detecção por citometria de fluxo. Se medir a liberação de citocinas no sobrenadante por ELISA ou métodos semelhantes - então esta etapa pode ser ignorada.
- Colocar a placa numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2 durante mais 4 h.
