Dinâmica do cálcio de imagem em células pancreáticas: uma técnica para estudar mudanças em tempo real na concentração citosólica de cálcio em ilhotas pancreáticas

Resumo

Fonte: Hamilton, A., et. al. Imaging Calcium Dynamics in Subpopulações de células de ilhotas pancreáticas de camundongos. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a técnica de imagem de células de ilhotas em tempo real, para estudar as mudanças na concentração de cálcio citosólico nas subpopulações menores das células das ilhotas pancreáticas. Subpopulações de células menores podem ser identificadas usando respostas funcionais a compostos marcadores, como adrenalina e grelina, que induzem alterações no cálcio citosólico em populações específicas de células de ilhotas. Isso pode fornecer uma visão sobre a conversa cruzada entre a glicose no sangue e a saída secretora das ilhotas.

Protocolo

1. Carregue o corante ou expresse o sensor

1. Prepare o corante que pode ser capturado.
   1. Dissolva a alíquota (normalmente, 50 μg) do corante aprisionável (por exemplo, Fluo-4) em DMSO até uma concentração de estoque de 2 mM. Adicione ácido plurônico a uma concentração final de 1% (usando um estoque de 20% em DMSO), para melhorar a solubilização do corante.
   2. Alíquota do corante em pequenos tubos de PCR (2 μL em cada). O corante pode ser armazenado congelado (-20 °C) por várias semanas.
2. Como alternativa, prepare o sensor recombinante.
   1. Distribuir o sensor (por exemplo, vetor adenoviral que codifica GCaMP6f) em alíquotas de 10 μL e conservá-lo a -80 °C.
   2. (Opcionalmente) pré-teste o título do estoque viral infectando ilhotas (como abaixo) usando várias diluições seriadas, para revelar a concentração ideal para infecção.
      nota: Sensores recombinantes codificados por diferentes vetores (lentivírus, BacMam, AAV) requerem um protocolo de infecção diferente. Certifique-se de verificar isso com o provedor de vetores e otimizar a taxa de trabalho para suas necessidades. O estoque "de trabalho" do adenovírus pode ser armazenado a -20 °C e congelado/descongelado várias vezes. O ciclo excessivo de congelamento e descongelamento reduz o título efetivo do vírus.
3. Prepare a solução de imagem.
   1. Compõem a solução de imagem, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7,4, com NaOH).
   2. Formar um estoque de glicose (0,5 M) e manitol (0,5 M) na solução de imagem. O caldo pode ser armazenado na geladeira (4 °C) por várias semanas.
4. Carregue o corante reterrível.
   1. Preparar a solução de trabalho do corante dissolvendo 2 μL do corante em 600 μL da solução de imagem contendo 6 mM de glicose. A solução pode ser aquecida ou vórtice para melhorar a solubilização.
   2. Carregue as ilhotas isoladas na solução de trabalho do corante. O carregamento pode ser feito usando uma placa multipoços ou uma placa de Petri. Neste último caso, coloque uma gota de 100 μL da solução de trabalho no fundo de uma placa de Petri não adesiva (35 ou 60 mm) e pipete 10-30 ilhotas na gota.
   3. No caso de diferentes grupos de ilhotas (por exemplo, tipo selvagem/knock-out), organize vários poços e várias gotículas para que o carregamento possa ser feito simultaneamente.
   4. Incube as ilhotas na solução de trabalho do corante em temperatura ambiente na escuridão por 70-90 minutos. Não incube demais.
   5. Verifique a carga sob o microscópio de fluorescência; as ilhotas devem ganhar fluorescência leve, com algumas células sendo mais brilhantes que as demais. O arredondamento das células e a localização nuclear do corante são sinais de sobrecarga.
   6. Transfira as ilhotas para uma solução de imagem sem corante contendo 6 mM de glicose. As ilhotas podem ser usadas para imagens imediatamente, mas, opcionalmente, o corante pode ser deixado para desesterificar por mais 10 a 15 minutos. As ilhotas retêm o corante por várias horas e, portanto, podem ser usadas para imagens em vários turnos.
5. Alternativamente, infecte as ilhotas com o vetor recombinante.
   1. Plaquear as ilhotas em gotículas em meio de cultura RPMI (RMPI1640 (ver Tabela de Materiais), suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, 100 unidades / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina. Distribuir o meio em duas placas de Petri de plástico de 60 mm (não tratadas com qualquer adesivo) e manter as placas na incubadora (37 °C, 5% CO₂, humidade absoluta)). (por exemplo, 30 μL), para minimizar o volume de vetor necessário.
   2. Adicione o vetor a uma proporção de aproximadamente 10⁵ unidades infecciosas / ilhota que idealmente resulte em multiplicidade de infecção >2. Idealmente, a proporção deve ser otimizada para a proporção mínima que forneceria expressão na camada periférica. A pré-titulação (etapa 1.2.2) pode ajudar.
   3. Introduza 20-50 ilhotas na gota e cultive por 8-48 horas. (Idealmente, durante a noite). As ilhotas devem desenvolver uma fluorescência verde fraca na maioria das células, sem alterações na morfologia celular.
      nota: O sucesso da infecção e da expressão depende do tempo de exposição à solução do vírus. Idealmente, o vírus deve permanecer na solução durante a noite, mas pode ser removido opcionalmente após apenas 15 minutos. No entanto, a infectividade e, portanto, a expressão, provavelmente serão drasticamente menores.

2. Dinâmica de imagem de Ca²⁺

1. Imobilize as ilhotas sob o microscópio (invertido).
   1. Monte a câmara de imagem para microscopia invertida. Posicione a lamínula de vidro (espessura 1 ou 1,5) dentro da câmara e certifique-se de que a interface da câmara de vidro seja estanque. Verifique se a lamínula está ao alcance da objetiva do microscópio (crítico para o caso de uma objetiva volumosa de alta NA).
   2. Prepare os acessórios de imobilização. Corte pequenos retângulos (20 mm x 20 mm) da malha fina e da malha grossa. Introduza duas "paredes" espaçadoras na malha fina usando uma fita adesiva de 45-50 μm de espessura. Use camadas duplas do espaçador se o tamanho das ilhotas a serem fotografadas exceder substancialmente os 100 μm convencionais.
   3. Mergulhe as malhas e o peso na solução de imagem usando uma placa de Petri de 35 mm. Certifique-se de que o plástico e o metal estejam molhados.
   4. Sob um microscópio de dissecação, vire a malha fina com as "paredes" espaçadoras de cabeça para baixo, os espaçadores voltados para cima. Escolha várias ilhotas carregadas com o corante aprisionável ou extraindo o sensor recombinante com uma pipeta P20 e posicione-as suavemente em cima da malha fina, entre os dois espaçadores. Certifique-se de que a malha e as arruelas não contenham quantidades excessivas da solução de imagem.
   5. Pegue a malha com as ilhotas, usando uma pinça de relojoeiro, e posicione-a de cabeça para baixo dentro da câmara de imagem, de modo que os espaçadores fiquem voltados para baixo e fiquem diretamente na lamínula da câmara. Certifique-se de que as ilhotas estejam presas entre os espaçadores e a malha, no meio da lamínula.
   6. Posicione a malha grossa e o peso em cima da malha fina dentro da câmara. Introduza a solução de imagem na câmara. Certifique-se de que as ilhotas estejam imobilizadas e prontas para serem fotografadas. Evite agitação excessiva da câmara (pequenas perturbações, como transportar a câmara para o microscópio e inseri-la em um estágio aquecido, são aceitáveis).
      nota: Um arranjo de imobilização semelhante pode ser aplicado para um sistema vertical.
2. Configure o microscópio.
   1. Escolha o modo de imagem e a objetiva, posicione a câmara com as ilhotas da etapa 2.1 no estágio de temperatura controlada do microscópio.
      1. Defina o controle de temperatura (idealmente, entre 30 °C e 36 °C) e a perfusão. Para um sistema invertido, posicione o fluxo de entrada abaixo do fluxo de saída dentro da câmara e defina o fluxo de saída para ser maior que o do fluxo de entrada (o que normalmente é obtido usando uma tubulação de diâmetro interno maior em uma bomba peristáltica).
      2. Certifique-se de que o fluxo de saída tenha uma superfície de contato mínima com a solução, de modo que remova a solução em várias pequenas gotículas sequenciais, evitando longos intervalos de remoção contínua da solução. Este último é a principal fonte de artefato na imagem de lapso de tempo dos sinais periódicos, pois eles aparecem como oscilações periódicas regulares de intensidade de cada pixel fotografado e são frequentemente interpretados como "ondas lentas".
      3. Inicie a perfusão com a solução de imagem contendo 3 mM de glicose.
   2. Escolha o caminho da luz e os filtros para a imagem dos fluoróforos verdes; excitação entre 470 e 500 e emissão entre 505 e 550 funcionariam para cada um deles.
   3. Execute imagens ao vivo para configurar os parâmetros de imagem. Ajuste a vista para capturar as ilhotas de interesse.
   4. Otimize a relação sinal-ruído da imagem. Para isso, ajustar a intensidade da luz de excitação, o tempo de exposição e o binning. Certifique-se de que as configurações permitam uma visualização distinta de cada célula dentro da ilhota com a menor intensidade de luz e exposição possíveis.
   5. Execute a aquisição de imagens. Dependendo da tarefa, as imagens podem ser tiradas de 0,1 a 5 Hz. Isso está bem abaixo dos critérios de Nyquist para as oscilações rápidas impulsionadas por Na⁺ em células de α e δ (>300 Hz), o que significa que os dados são subamostrados por padrão. No entanto, aumentar a frequência de aquisição para atender a essa demanda não é viável em imagens multicelulares/multi-ilhotas com um grande campo de visão. O GCaMP pode ser visualizado mais rapidamente, enquanto o Fluo4 inevitavelmente branqueará sob condições de aquisição rápida.
      nota: Dado que as oscilações de [Ca²⁺] _citos nas células das ilhotas são impulsionadas pela atividade elétrica, o uso de baixas taxas de aquisição pode parecer contraproducente. Na realidade, no entanto, as taxas de aquisição em torno ou acima de 1 Hz podem ser suficientes para resolver o comportamento de pico de células β, enquanto o limite para detecção de oscilações acionadas por canais de sódio em células α e δ está bem acima de 300 Hz. Se as oscilações de α ou δ células [Ca²⁺] _são adquiridas a 1 Hz ou 0,1 Hz, elas serão severamente subamostradas e refletirão o manuseio de Ca²⁺ pela célula em vez da atividade elétrica.
      1. Verifique a qualidade dos dados adquiridos: a 3 mM de glicose, a atividade das células α deve ser claramente visível/detectável. Certifique-se de que este é o caso e prossiga para a imagem de lapso de tempo em escala real.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Objetivo 40x/1,3
GCaMP6f, em vetor adenoviral (tipo humano 5)	Biolabs de vetor	1910
Soro fetal bovino	Sigma-Aldrich	Rolamento F7524-500ML
RPMI médio	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
penicilina/estreptomicina	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
Microscópio Axiovert 200
Fluo4	Thermo Fisher (Tecnologias de Vida)	F14201