Isolamento primário de células acinares: um método para isolar células acinares do pâncreas de camundongos

Resumo

Fonte: Fleming Martinez, A. K., et al. Imitando e manipulando a metaplasia pancreática acinar-ductal em cultura de células tridimensionais. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a técnica usada para isolar células acinares pancreáticas - células exócrinas - contendo uma variedade de enzimas digestivas. As células acinares primárias são úteis no estudo ex vivo da metaplasia acinar-ductal (ADM) - um evento precoce no desenvolvimento do câncer de pâncreas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária jove.

1. Isolamento de células acinares

1. Sacrifique o camundongo por meio da indução de CO ₂ e realize a luxação cervical. Disseque imediatamente o pâncreas. Para dissecar o pâncreas, primeiro prenda as patas do camundongo na tampa de poliestireno, oriente o camundongo de forma que a cauda fique voltada para o pesquisador e borrife o abdômen com etanol 70%.
   nota: O camundongo usado nos resultados representativos foi uma fêmea não transgênica de 12 semanas de idade com fundo C57BL / 6. A seleção do mouse é discutida mais detalhadamente na seção de discussão.
   1. Usando um conjunto de tesouras e pinças autoclavadas, levante o pelo/pele com a pinça na linha média e use a tesoura para fazer uma incisão através do pelo e da pele da abertura uretral até a área do diafragma/caixa torácica.
   2. Faça incisões adicionais à esquerda e à direita, de modo que o pelo/pele seja cortado para criar uma visão clara da cavidade abdominal. Em seguida, corte o revestimento peritoneal (no meio e à direita e à esquerda) e puxe-o para longe dos órgãos, como foi feito com o pêlo / pele.
   3. Levante os intestinos com a pinça e coloque-a no lado esquerdo do mouse, criando espaço para ver o pâncreas, que é de cor rosa claro, e preso ao baço, que é um oval vermelho escuro. O tecido pancreático se distingue por sua textura macia e esponjosa. Corte o pâncreas que correrá ao longo do estômago e se entrelaçará com os intestinos.
   4. Separe o baço do pâncreas. Em seguida, colocar o pâncreas em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de HBSS com 1x penicilina-estreptomicina e levá-lo à capela de fluxo laminar.
      nota: As etapas restantes do protocolo devem ser feitas utilizando técnica estéril em uma capela de fluxo laminar.
2. Despeje o pâncreas e o HBSS (com penicilina-estreptomicina) em um recipiente de pesagem vazio e, usando uma pinça, lave o pâncreas girando-o. Em seguida, mova o pâncreas com a pinça para um segundo barco de pesagem contendo HBSS (com penicilina-estreptomicina). Novamente, lave o pâncreas girando.
3. Mova o pâncreas para o terceiro recipiente de pesagem contendo HBSS (com penicilina-estreptomicina) e comece a cortar o pâncreas em pequenos pedaços de 5 mm ou menos. Em seguida, despeje os pedaços de pâncreas e HBSS em um tubo vazio de 50 mL.
   1. Para fazer isso, use a pinça para mover os pedaços do pâncreas para o líquido enquanto o barco de pesagem está sendo inclinado. Despeje quando todas as peças não estiverem mais presas ao barco de pesagem. Pegue os pedaços restantes com a pinça e lave a pinça no tubo de 50 mL contendo o pâncreas em HBSS com penicilina-estreptomicina.
4. Centrifugue a 931 x g por 2 min a 4 °C e, em seguida, remova o HBSS (e qualquer gordura que esteja flutuando) pipetando-o com uma pipeta de 5 mL.
5. Adicione 5 mL de colagenase (faça 40 mL de HBSS + 5% de FBS, 20 mL de HBSS + 30% de FBS e 5 mL de colagenase de 2 mg/mL em HBSS. Esterilizar a colagenase por filtração (poro de 0,22 μm) e manter à temperatura ambiente. Mantenha cada uma das soluções HBSS no gelo) no pâncreas. Garantir uma tampa selada envolvendo o tubo de 50 mL em filme plástico de parafina e, em seguida, colocá-lo em uma incubadora agitando a 220 rpm por 20 min a 37 °C.
   nota: O tempo de digestão da colagenase pode variar, conforme observado na discussão. No final da incubação, nenhum pedaço grande de tecido deve permanecer.
6. Para interromper a dissociação, coloque o tubo contendo pâncreas no gelo e adicione 5 mL de HBSS frio + 5% de FBS. Centrifugue a 931 x g durante 2 min a 4 °C e, em seguida, pipete o sobrenadante utilizando uma pipeta de 5 ml.
7. Ressuspender em 10 ml de HBSS + 5% de FBS e centrifugar a 931 x g durante 2 min a 4 °C. Retirar o sobrenadante com uma pipeta de 5 ml e repetir este passo com mais 10 ml de HBSS + 5% de FBS.
8. Ressuspenda em 5 mL de HBSS + 5% de FBS e, usando um P1000, transfira 1 mL de cada vez através de uma malha de 500 μm para um tubo de 50 mL. Adicione mais 5 mL de HBSS + 5% de FBS através da malha com um P1000 para lavar quaisquer células pancreáticas restantes através da malha.
9. Coloque a suspensão celular da malha de 500 μm através da malha de 105 μm pipetando 1 mL de cada vez usando um P1000. Em seguida, pipete suavemente a suspensão celular em um tubo contendo HBSS + 30% FBS. Uma camada de suspensão celular se formará no topo; Após a centrifugação, as células acinares afundam para formar um pellet.
10. Centrifugue a 233 x g por 2 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1x meio completo do Waymouth.
    1. Se proceder diretamente à incorporação de células na matriz de colágeno ou membrana basal, ressuspenda em um volume de 7 mL por pâncreas. Se estiver a proceder a uma infeção adenoviral ou lentiviral, ressuspenda em 4 ml por pâncreas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora com agitação a 37 °C	Thermo Científico	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubadora	NUAIRE	NU-5500
Tubos de 50 ml	falcão	Rolamento 352070
Almofada absorvente, 20" x 24"	Marca de pescador	1420662
Agulha de deslizamento de precisão BD 21G x 1/2	Fisher Científico	305167	Use como pinos para dissecação
Copo, 600 mL	Marca de pescador	FB-101-600
centrifuga	Beckman Coulter	Centrífuga Allegra X-15R
Colagenase tipo I, Clostridium histolyticum	sigma	C0130-1G	Crie uma solução de 100 mg/ml dissolvendo o pó em água estéril de grau de biologia molecular. Ao descongelar uma alíquota, diluir a 10 mg/ml, filtrar esterilizar e colocar alíquotas de 1 ml a -20 °C.
dexametasona	sigma	D1756	Criar uma solução de 4 mg/ml dissolvendo o pó em metanol, alíquota e armazenando a -20 °C.
Etanol, 200 provas	Laboratórios Decon	2701
Soro fetal bovino	sigma	F0926-100mL
fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	11002-12
fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 91127-12
Solução salina balanceada de Hank (HBSS), sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol	Fisher Científico	SH3048801
Balde de gelo, retangular	Fisher Científico	07-210-103
Sacos de amostras LAB GUARD (para camundongo após dissecação)	Minigrip	SBL2X69S
Parafilme	Bemis	PM992	Referido como 'filme plástico de parafina' no manuscrito
Pbs	Fisher Científico	SH30028.02
Penicilina-estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Ponteiras de pipeta, 10 μl	EUA Científico	1110-3700
Ponteiras de pipeta, 1000 μl	Plásticos Olympus	24-165RL
Ponteiras de pipeta, 200 μl	EUA Científico	1111-1700
Pipeta-Auxiliar	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl	Gilson	F123601
Pipetas de 10 ml	falcão	357551
Pipetas de 25 ml	falcão	357525
Pipetas de 5 ml	falcão	357543
Malha de polipropileno, 105 μm	Laboratórios de espectro	146436
Malha de polipropileno, 500 μm	Laboratórios de espectro	146418
tesoura	Ferramentas de Belas Ciências	14568-12
tesoura	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 14568-13
Bicarbonato de sódio (pó branco fino)	Fisher Científico	BP328-500
hidróxido de sódio	Fisher Científico	S318-500
Inibidor de tripsina de soja	Gibco	17075029
espátula	Marca de pescador	Telefone: 21-401-10
Steriflip 50 ml, filtros de 0,22 mícron	Millipore	SCGP00525
Colágeno de cauda de rato tipo I	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Médio (pó)	sigma	W1625-10X1L
Barco de pesagem, hexagonal, médio	Marca de pescador	02-202-101