Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de Materiais, Soluções e Bases de Matrizes Tridimensionais
- Corte malhas de polipropileno de 500 μm e 105 μm em quadrados de 76 mm por 76 mm. Dobre cada quadrado ao meio duas vezes para criar um quadrado dobrado menor. Coloque um quadrado de malha de 500 μm e um de 105 μm em uma bolsa autoclavável.
- Quadrados de malha de polipropileno em autoclave, bem como dois pares de tesouras e pinças.
- Faça 100 mL de solução 10x Waymouth. Misture 1 frasco (14 g) do pó de Waymouth em 50 mL de água deionizada (DI) e, quando dissolvido, adicione 30 mL de bicarbonato de sódio a 7,5% (75 g / L). Traga o volume final para 100 mL usando água DI e esterilize com filtro.
- Armazene 10x a mídia da Waymouth a 4 °C e use para preparar géis de colágeno e 1x a mídia da Waymouth. Quando os precipitados se formarem, descarte.
- Faça 50 mL de 1x meio completo da Waymouth por pâncreas adicionando 125 μL de inibidor de tripsina de soja 40 mg/mL, 12,5 μL de dexametasona 4 mg/mL e 500 μL de soro fetal bovino (FBS). Esterilizar por filtração e usar dentro de 48 h.
- Prepare bases de matriz tridimensionais usando colágeno ou matriz de membrana basal (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre o produto). Ao pipetar a base, coloque a placa no gelo, evite bolhas e gire a placa imediatamente após pipetar o volume de cada poço para garantir a cobertura total.
- Crie bases de colágeno misturando os seguintes componentes em gelo em uma capa de cultura de tecidos: 5,5 mL de colágeno de cauda de rato tipo I, 550 μL de 10x Waymouth's Media e 366,6 μL de NaOH 0,34 M (filtrado).
NOTA: Esta é uma solução suficiente para fazer bases de colágeno para uma placa de 24 poços, 12 ou 6 poços. Uma placa é suficiente para o isolamento acinar de um pâncreas.
- Use os seguintes volumes para revestir a base de colágeno: 80 μL (lâmina de vidro de 8 poços), 200 μL (placa de 24 poços), 400 μL (placa de 12 poços) ou 800 μL (placa de 6 poços).
- Para as bases da matriz da membrana basal, pipete a matriz sem nenhum componente adicional. Use os seguintes volumes para cada poço: 50 μL (lâmina de vidro de 8 poços), 120 μL (placa de 24 poços), 240 μL (placa de 12 poços) ou 600 μL (placa de 6 poços).
- Deixe as bases solidificarem por pelo menos 30 min em uma incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO2) antes de criar uma segunda camada de matriz com células embutidas em cima dessas bases.
- Em preparação para o isolamento acinar, mantenha um béquer de 600 mL, três tubos de 50 mL, uma tesoura autoclavada, uma pinça autoclavada e um balde de gelo sob o capô com três barcos de pesagem. Em seguida, faça 30 mL de HBSS com 300 μL de 100x penicilina-estreptomicina, colocando 10 mL em cada um dos dois barcos de pesagem e mantendo os 10 mL finais em um tubo de 50 mL (para uso nas etapas 1.8.2 e 2.1.4).
- Faça 40 mL de HBSS + 5% de FBS, 20 mL de HBSS + 30% de FBS e 5 mL de colagenase 2 mg/mL em HBSS. Esterilizar a colagenase por filtração (poro de 0,22 μm) e manter à temperatura ambiente. Mantenha cada uma das soluções HBSS no gelo.
- Monte um espaço de trabalho para dissecção do pâncreas, que pode ser feita em uma bancada de laboratório.
- Coloque uma almofada absorvente sobre a mesa, junto com uma tampa de poliestireno coberta com papel alumínio. Em seguida, coloque uma toalha de papel com 4 alfinetes em cima do papel alumínio.
- Mantenha os seguintes itens ao alcance do espaço de trabalho de dissecação: uma bolsa de incineração, um conjunto de tesouras e pinças autoclavadas, um borrifador com etanol a 70% e um balde de gelo (com o tubo de 50 mL de HBSS contendo penicilina-estreptomicina da etapa 1.6).
- Regular uma centrífuga para 4 °C e um agitador para 37 °C.
2. Isolamento de células acinares
- Sacrifique o camundongo por meio da indução de CO2 e realize a luxação cervical. Disseque imediatamente o pâncreas. Para dissecar o pâncreas, primeiro prenda as patas do camundongo na tampa de poliestireno, oriente o camundongo de forma que a cauda fique voltada para o pesquisador e borrife o abdômen com etanol 70%.
NOTA: O camundongo usado nos resultados representativos era uma fêmea não transgênica de 12 semanas com fundo C57BL / 6. A seleção do mouse é discutida mais detalhadamente na seção de discussão.
- Usando um conjunto de tesouras e pinças autoclavadas, levante o pelo/pele com a pinça na linha média e use a tesoura para fazer uma incisão através do pelo e da pele da abertura uretral até a área do diafragma/caixa torácica.
- Faça incisões adicionais à esquerda e à direita, de modo que o pelo/pele seja cortado para criar uma visão clara da cavidade abdominal. Em seguida, corte o revestimento peritoneal (no meio e à direita e à esquerda) e puxe-o para longe dos órgãos, como foi feito com o pêlo / pele.
- Levante os intestinos com a pinça e coloque-a no lado esquerdo do mouse, criando espaço para ver o pâncreas, que é de cor rosa claro, e preso ao baço, que é um oval vermelho escuro. O tecido pancreático se distingue por sua textura macia e esponjosa. Corte o pâncreas que correrá ao longo do estômago e se entrelaçará com os intestinos.
- Separe o baço do pâncreas. Em seguida, colocar o pâncreas em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de HBSS com 1x penicilina-estreptomicina e levá-lo à capela de fluxo laminar.
nota: As etapas restantes do protocolo devem ser feitas utilizando técnica estéril em uma capela de fluxo laminar.
- Despeje o pâncreas e o HBSS (com penicilina-estreptomicina) em um recipiente de pesagem vazio e, usando uma pinça, lave o pâncreas girando-o. Em seguida, mova o pâncreas com a pinça para um segundo barco de pesagem contendo HBSS (com penicilina-estreptomicina). Novamente, lave o pâncreas girando.
- Mova o pâncreas para o terceiro recipiente de pesagem contendo HBSS (com penicilina-estreptomicina) e comece a cortar o pâncreas em pequenos pedaços de 5 mm ou menos. Em seguida, despeje os pedaços de pâncreas e HBSS em um tubo vazio de 50 mL.
- Para fazer isso, use a pinça para mover os pedaços do pâncreas para o líquido enquanto o barco de pesagem está sendo inclinado. Despeje quando todas as peças não estiverem mais presas ao barco de pesagem. Pegue os pedaços restantes com a pinça e lave a pinça no tubo de 50 mL contendo o pâncreas em HBSS com penicilina-estreptomicina.
- Centrifugue a 931 x g por 2 min a 4 °C e, em seguida, remova o HBSS (e qualquer gordura que esteja flutuando) pipetando-o com uma pipeta de 5 mL.
- Adicione 5 mL de colagenase (diluída em HBSS na etapa 1.7) ao pâncreas. Garantir uma tampa selada envolvendo o tubo de 50 mL em filme plástico de parafina e, em seguida, colocá-lo em uma incubadora agitando a 220 rpm por 20 min a 37 °C.
NOTA: O tempo de digestão da colagenase pode variar, conforme observado na discussão. No final da incubação, nenhum pedaço grande de tecido deve permanecer.
- Para interromper a dissociação, coloque o tubo contendo pâncreas no gelo e adicione 5 mL de HBSS frio + 5% de FBS. Centrifugue a 931 x g durante 2 min a 4 °C e, em seguida, pipete o sobrenadante utilizando uma pipeta de 5 ml.
- Ressuspender em 10 ml de HBSS + 5% de FBS e centrifugar a 931 x g durante 2 min a 4 °C. Retirar o sobrenadante com uma pipeta de 5 ml e repetir este passo com mais 10 ml de HBSS + 5% de FBS.
- Ressuspenda em 5 mL de HBSS + 5% de FBS e, usando um P1000, transfira 1 mL de cada vez através de uma malha de 500 μm para um tubo de 50 mL. Adicione mais 5 mL de HBSS + 5% de FBS através da malha com um P1000 para lavar quaisquer células pancreáticas restantes através da malha.
- Coloque a suspensão celular da malha de 500 μm através da malha de 105 μm pipetando 1 mL de cada vez usando um P1000. Em seguida, pipete suavemente a suspensão celular em um tubo contendo HBSS + 30% FBS. Uma camada de suspensão celular se formará no topo; Após a centrifugação, as células acinares afundam para formar um pellet.
- Centrifugue a 233 x g por 2 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1x meio completo do Waymouth.
- Se proceder diretamente à incorporação de células na matriz de colágeno ou membrana basal, ressuspenda em um volume de 7 mL por pâncreas. Se estiver a proceder a uma infeção adenoviral ou lentiviral, ressuspenda em 4 ml por pâncreas.
3. Infecção Viral
- Como um pâncreas é suficiente para duas infecções virais (controle e experimental, por exemplo, nulo e cre), divida a suspensão celular entre as pálpebras de duas placas de 35 mm. O uso da tampa das placas permite a infecção em suspensão e, portanto, fácil movimentação para o substrato final posteriormente.
- Ao trabalhar com vírus, mergulhe todas as pontas de pipeta usadas em água sanitária a 10% por pelo menos 15 minutos.
nota: A utilização das placas de 35 mm e do volume de 4 mL funciona bem para células de camundongos não transgênicos entre 8 e 16 semanas de idade. O tamanho e o volume da placa podem precisar ser ajustados para animais com pâncreas menor ou maior.
- Para infecção por adenovírus, adicione o vírus (com um título de pelo menos 107 TU / mL) em uma diluição de 1:1.000 na tampa de cada placa e agite (Figura 1, adenovírus GFP). Coloque as placas em uma incubadora de cultura de células (37 °C, 5% CO2) e agite a cada 15 minutos por 1 h. Continue a incubação por mais 2 h e, em seguida, prossiga para a incorporação das células no colágeno ou na matriz da membrana basal.
- Depois de concluir o trabalho viral no capô, mergulhe todos os componentes do exaustor com alvejante a 10% por pelo menos 15 minutos e, em seguida, limpe completamente o alvejante com etanol a 70%.
4. Incorporação de células na matriz de colágeno ou membrana basal
- Faça gel de colágeno no gelo combinando 7 mL de colágeno de cauda de rato tipo I (3,3 mg / mL), 700 μL de meio 10x Waymouth e 466,6 μL de NaOH 0,34 M.
- Tomando volumes iguais de gel de colágeno e suspensão celular, misture suavemente. Se adicionar um estímulo ou inibidor, combine-o com a suspensão de células de colágeno. Placa um poço de cada vez (placas da etapa 1.5.3); Mantendo o prato no gelo, gire para distribuir uniformemente a camada de células de colágeno.
- Em cada poço, pipete os seguintes volumes de suspensão de células de colágeno: 200 μL (lâmina de vidro de 8 poços), 500 μL (placa de 24 poços), 1000 μL (placa de 12 poços) ou 2000 μL (placa de 6 poços). Observe que a ADM é induzida por estimulação com TGF-α (50 ng/mL) na Figura 1.
- Para o embutimento de células na matriz da membrana basal, misture a matriz da membrana basal de uma parte com a suspensão celular de duas partes. Tal como acontece com o colágeno, mantenha a suspensão da célula da matriz, bem como a placa, no gelo. Picar um poço de cada vez usando os mesmos volumes indicados em 4.2.1 e girar para uma distribuição uniforme.
- Coloque a placa em uma incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO2) por 30 min para solidificar e, em seguida, adicione 1x o meio completo do Waymouth com qualquer estímulo ou inibidor (a Figura 1 usa TGF-α a 50 ng / mL). Mude a mídia (com estímulo ou inibidor) no dia seguinte e depois em dias alternados. Dependendo do estímulo, a ADM pode ser observada entre o dia 3 e o dia 5.
