Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
As ferramentas cirúrgicas necessárias são mostradas na Figura 1 e o diagrama esquemático do procedimento é mostrado na Figura 2.
1. Soluções
- Prepare a Solução Salina Balanceada de Hank (HBSS) adicionando 100 mL de 10X HBSS (do estoque) a 900 mL de água destilada para fazer 1 L de HBSS (1X).
- Prepare a solução STOP (deve ser fresca e deve ser usada dentro de 1 h) adicionando 50 mL de soro fetal bovino 100X (FBS) a 450 mL de 1X HBSS gelado; isso perfaz 500 mL de solução STOP. Manter a solução STOP a 4 °C.
- Prepare a solução de colagenase P (deve ser fresca dentro de 1 h após o uso) adicionando 1 mg / mL de colagenase P ao 1X HBSS gelado; use 6 mL / camundongo.
- Adicionar 0,05% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) à solução de colagenase P (isso fornece nutrientes para as ilhotas isoladas). Por exemplo, use 3 mg de BSA em 6 mL de solução de colagenase P. Mantenha no gelo.
- Calcule e prepare a quantidade de colagenase P necessária para todos os camundongos em um tubo de 50 mL.
- Prepare o meio RPMI 1640 completo adicionando 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, suplemento de células INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio e 0,05 mM de 2-mercaptoetanol) a 500 mL de meio RPMI 1640 contendo 5,5 mM de glicose para ser usado para cultura e incubação durante a noite.
2. Preparação
- Encha três tubos de 50 mL de solução inibidora de RNase de 25 mL, etanol a 70% ou H2O destilado. Essas soluções serão usadas para limpar as ferramentas cirúrgicas antes e durante o procedimento.
- Mergulhe as pontas das ferramentas na solução inibidora de RNase por 30 minutos antes de iniciar o protocolo; isso elimina qualquer RNase potencial nas ferramentas.
- Almofadas absorventes pré-cortadas para 6 pol x 6 de tamanho para uso durante a cirurgia.
- Prepare 1X solução HBSS com antecedência e armazene a 4 ° C. Prepare a solução STOP antes da cirurgia. Conservar a 4 °C.
- Prepare a solução de colagenase P imediatamente antes da cirurgia e armazene no gelo.
nota: Isso deve ser usado dentro de 2 h após a preparação.
- Rotular tubos de 50 mL para digestão e purificação; preparar 2 tubos para cada rato, um para digestão e outro para purificação de ilhotas. Certifique-se de que a identificação do animal esteja em ambos os tubos.
- Adicione 3 mL de solução de colagenase P no primeiro tubo de 50 mL. Os 3 mL restantes de colagenase P serão injetados.
- Retire os 3 ml restantes da solução de colagenase para uma seringa de 3 ml montada com 30 G 1/2 pol. Coloque a seringa no gelo.
3. Procedimento
- Remova todas as ferramentas da solução inibidora de RNase, mergulhe-as primeiro no tubo com etanol a 70%, depois no tubo contendo H2O destilado e seque ao ar em papel toalha limpo.
- Coloque o camundongo em uma câmara contendo 0,5 mL de isoflurano até que o camundongo esteja profundamente anestesiado.
- Remova o mouse da câmara e verifique o estado da anestesia beliscando uma almofada do pé com uma pinça. A anestesia profunda é baseada na observação de que a respiração se torna cada vez mais lenta e o camundongo não reage ao beliscão do pé. Depois de confirmar que o camundongo está profundamente anestesiado, eutanasiar o camundongo com luxação cervical e, em seguida, coloque-o na almofada absorvente.
- Coloque o rato anestesiado de bruços, aplicando pressão no pescoço e deslocando a coluna vertebral do cérebro puxando a cauda.
- Prenda os membros do camundongo em decúbito dorsal na almofada absorvente, borrife o corpo com etanol 70% e limpe o excesso de etanol.
- Use pinças de vidro de cobertura e tesouras cirúrgicas curvas para fazer incisões. Primeiro faça uma incisão horizontal na pele da região abdominal (~3 cm), abra bem a pele para expor a parede abdominal. Em seguida, faça uma incisão vertical (~ 3–4 cm) no peritônio abdominal para expor totalmente o pâncreas na cavidade abdominal (Figura 3).
- Empurre os lobos do fígado superiormente para expor o ducto biliar, ele aparecerá como um tubo rosa pálido (Figura 3).
- Mova cuidadosamente os intestinos da região lombar/ilíaca direita da cavidade abdominal para a direita, expondo o ducto biliar e a artéria hepática (Figura 3).
- Clampeie cuidadosamente o ducto biliar comum usando os micro serrefines de Schwartz (Figura 1) o mais próximo possível do fígado.
- Identifique a ampola de Vater, que está localizada na papila duodenal, formada pela união do ducto pancreático e do ducto colédoco. A ampola de Vater parece inchada quando vista ao microscópio de dissecção, que é o ponto de entrada para o ducto colédoco (Figura 4).
nota: Ajustar a intensidade / ângulo da luz do microscópio de dissecção pode facilitar a localização.
- Insira a seringa com 3 ml da solução de colagenase P na ampola de Vater. Empurre a agulha para dentro do ducto por cerca de 1/4 do comprimento do ducto colédoco (a ampola leva ao ducto), conforme mostrado na Figura 5.
- Uma vez que a agulha esteja na ampola, certifique-se de que a orientação da agulha seja tal que fique paralela ao ducto.
- Estabilize a agulha clampeando com pinça micro Adson para evitar que perfure o ducto (Figura 5).
- Injete lenta e firmemente 3 mL da solução de colagenase P da seringa no ducto colédoco (o suficiente para sentir resistência), conforme mostrado na Figura 6. O objetivo é criar pressão de refluxo para forçar a colagenase a entrar no ducto pancreático. A injeção é considerada bem-sucedida se a região da cabeça, pescoço, corpo e cauda do pâncreas estiverem totalmente inflados.
nota: O rendimento das ilhotas será baixo se o pâncreas não estiver totalmente inflado ou a área esplênica não estiver totalmente inflada. A área esplênica contém o maior número de ilhotas6. A inflação pode ser confirmada pelo aparecimento de espaços abertos entre o tecido pancreático que são preenchidos com solução.
- Disseque cuidadosamente o pâncreas inflado e coloque-o em um tubo de digestão de 50 mL contendo 3 mL de solução gelada de colagenase P.
- Remova o pâncreas usando 2 pinças (curva e Micro Adson; Veja a Figura 1): (a partir do baço, afaste o pâncreas do baço e continue retirando do estômago e ao longo do duodeno.
nota: Não são necessárias incisões.
- Pique o pâncreas por 3-5 s no tubo de digestão com 3 mL de solução gelada de colagenase P usando uma tesoura cirúrgica fina (Figura 7A).
- Prenda o tubo a uma prateleira em banho-maria a 37 °C e agite a 100–120 rpm por aproximadamente 12–13 min.
- Após a incubação, agite suavemente os tubos com a mão para romper o tecido até que a solução de digestão da colagenase P se torne homogênea (Figura 7B). A homogeneidade é confirmada por uma aparência arenosa de partículas finas do pâncreas. Cerca de 30 segundos de aperto de mão suave geralmente são suficientes. Segure o tubo contra a luz para examinar se o tecido está bem homogeneizado; agite por mais ~ 15 s, se necessário.
- Depois de digeridos, coloque imediatamente os tubos no gelo e adicione 40 mL de solução gelada STOP para encerrar a digestão enzimática.
nota: Neste ponto, os tubos de digestão podem ser deixados no gelo por até 2 h, se estiverem trabalhando em vários ratos.
- Centrifugue o tubo em uma centrífuga de balde oscilante a 300 x g por 30 s (a temperatura da centrífuga é flexível).
nota: Use uma centrífuga de balde oscilante de modo que o pellet de tecido seja formado na parte inferior do tubo de 50 mL e não na parede do tubo; Isso é fundamental para um melhor rendimento das ilhotas.
- Transvase e repita a centrifugação com a solução STOP mais 2 vezes, decantando a solução após cada centrifugação. Use 20 mL de solução STOP para cada lavagem subsequente.
- Antes de cada centrifugação, interrompa o pellet agitando suavemente o pellet de tecido no tubo de 50 mL em solução STOP de 20 mL.
- Ressuspenda o sedimento de tecido com 40 mL de HBSS gelado e centrifugue a 300 x g por 30 s.
- Transvase e repita a centrifugação com uma centrífuga de balde oscilante com solução HBSS mais duas vezes, decantando a solução após cada centrifugação. Use 20 mL de HBSS para cada lavagem.
- Antes de cada centrifugação, interrompa o pellet, para o separar do fundo do tubo, agitando suavemente o tubo que contém 20 ml de solução HBSS.
- Após a última centrifugação, remova todos os HBSS.
- Em seguida, adicione 5 mL de gradiente de densidade de temperatura ambiente ao tubo de 50 mL que contém o pellet. Vórtice brevemente em baixa velocidade até homogeneizar.
- Adicione mais 5 mL do gradiente de densidade de temperatura ambiente ao tubo de 50 mL. Não vórtice / misture.
nota: É fundamental permanecer estável e imóvel para permitir que um melhor gradiente se forme sem interrupções.
- Pipete 10 mL de tampão HBSS à temperatura ambiente no tubo (contendo o gradiente de densidade), gota a gota, suave e lentamente para permitir a formação de um gradiente. Use uma pistola de pipeta com uma pipeta de 10 mL para adicionar HBSS gota a gota.
- Usando uma centrífuga de balde oscilante, gire os tubos a 1700 x g por 15 min. Certifique-se de alterar a velocidade de aceleração/desaceleração para a configuração mais baixa para manter o gradiente (Figura 7C).
- Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos sem perturbar o gradiente. Usando uma pistola de pipeta pré-umedecida com HBSS frio (pipeta HBSS para cima e para baixo), pipete a camada de ilhotas (5–10 mL) formada entre o gradiente de densidade e o HBSS para o novo tubo de coleta de ilhotas de 50 mL.
nota: É útil umedecer a pipeta com HBSS frio antes de pipetar as ilhotas para evitar que as ilhotas grudem nas paredes internas da pipeta.
- Caso a separação seja incompleta, as ilhotas seriam visíveis na camada de gradiente de densidade, pipetar todos os 10 mL do gradiente de densidade (camada inferior) junto com a camada de ilhotas formada na interface (apenas para deixar cerca de 8 a 10 mL da camada superior do HBSS para trás).
nota: A coleta da camada de ilhotas e da camada de gradiente de densidade (camada inferior) pode resultar na coleta de detritos que podem prolongar o tempo de colheita das ilhotas, mas nenhuma outra etapa será alterada. A coleta dessas duas camadas não é necessária quando a camada de ilhotas está bem formada.
- Adicione 20 mL de HBSS gelado ao novo tubo de 50 mL contendo ilhotas e, em seguida, centrifugue a 350 x g por 3 min em uma centrífuga de balde oscilante.
- Após a centrifugação, pipete cuidadosamente (não decantar) o sobrenadante (deixe ~ 3 mL no fundo) sem perturbar o pellet contendo as ilhotas no fundo. Descarte o sobrenadante.
- Repita a lavagem e centrifugação pelo menos 3 vezes. Adicione 20 mL de HBSS de cada vez e certifique-se de suspender o pellet antes de cada centrifugação.
- Aqueça o frasco de mídia completo RPMI-1640 em banho-maria a 37 °C antes de usar. Após a última centrifugação, remova todo o HBSS e adicione 4 mL de meio RPMI-1640 completo previamente preparado (contendo FBS, suplemento de células INS-1 e penicilina/estreptomicina) ao pellet.
- Desaloje o pellet girando suavemente o tubo e despeje imediatamente o meio RPMI-1640 em uma placa de Petri de 100 mm. Adicione mais 5 mL de mídia RPMI-1640 ao tubo e agite-o suavemente para lavar as ilhotas restantes e, em seguida, despeje também a mídia na mesma placa de Petri.
- Sob um microscópio de dissecação, pegue ilhotas saudáveis da placa de Petri usando uma pipeta de 20 μL e coloque-as em uma nova placa de Petri contendo 10 mL de meio RPMI 1640 completo. Quando vistas sob um microscópio de dissecação, as ilhotas devem parecer esféricas / oblongas e de cor marrom-dourada com uma superfície lisa em comparação com o tecido exócrino relativamente transparente e fino.
nota: A ampliação do microscópio de dissecção é geralmente definida em 12,5–16x. O rendimento das ilhotas varia de acordo com vários fatores, incluindo cepa, idade e sexo do camundongo. Este protocolo geralmente produz 250-350 ilhotas saudáveis de camundongos C57BL / 6J saudáveis com idade entre 4 e 10 meses de idade.
- Incubar as ilhotas em uma incubadora estéril a 37 ° C com infusão de CO2 a 5% e ar umidificado a 95% durante a noite para experimentos no dia seguinte, ou congelar as ilhotas para análise desejada posteriormente.
- Uma vez que as ilhotas são congeladas, elas não podem ser usadas para ensaios de secreção, apenas quantificação de RNA ou proteína. Para coletar células para congelar, coloque-as em tampão HBSS, colete todas as ilhotas em 200–500 μL de tampão, transfira para tubo de 1,5 mL, centrifugue 350 x g por 1–2 min, remova o sobrenadante deixando não mais do que 30–40 μL de solução, coloque em -20 °C para armazenamento de curto prazo (vários dias) ou -80 °C para armazenamento de longo prazo.
