Coloração imunofluorescente de esferoides: uma técnica para analisar esferoides quanto à expressão de antígenos intra e extracelulares

Resumo

Fonte: Cavaco, A. C. M. et al. Um modelo esferóide 3D como um sistema mais fisiológico para estudos in vitro de diferenciação e invasão de fibroblastos associados ao câncer. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a técnica de coloração imunofluorescente de esferoides para entender a diferenciação dos fibroblastos ou CAFs. Este protocolo ajuda a detectar a expressão de antígenos intra e extracelulares, incluindo a deposição de proteínas ECM dentro dos esferoides.

Protocolo

1. Coloração imunofluorescente de esferoides

1. Coletar os esferóides após cerca de 24 h em um tubo de reação de 1,5 mL por condição experimental ou por proteína a ser analisada. Por exemplo, coloque os esferoides de iNFs estimulados com TGF-β1 em um tubo diferente dos iNFs de controle, que não foram tratados. Para evitar a ruptura de esferoides devido a forças de cisalhamento muito fortes, corte a extremidade da ponta da pipeta para ampliar o orifício. Incluir pelo menos 5-10 esferóides num tubo de reacção, para permitir réplicas e ter em conta as possíveis perdas durante as fases de lavagem.
2. Centrifugue os esferóides com uma centrífuga de bancada por cerca de 30-60 s a 1.000 x g. Remover cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose por pipetagem, sem perturbar os esferóides peletizados.
3. Lavar com 50 μL de 1x PBS. Repetir a etapa de centrifugação e remover cuidadosamente o PBS por pipetagem, como descrito no ponto 1.2.
4. Dependendo da proteína a ser corada, fixe com 50 μL de paraformaldeído a 4% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente (para αSMA, NG2 e integrina α3β1) ou com 50 μL de metanol por 10 min a -20 ° C (para subunidades de laminina-332).
5. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 1.2-1.3.
6. Permeabilize as células com 0,1% de Triton-X em PBS por 4 min em temperatura ambiente.
7. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 1.2-1.3 três vezes.
8. Incubar os esferoides em PBS contendo 5% de FBS e 2% de BSA, por 1 h em RT para bloquear locais de interação de proteínas não específicos.
9. Incubar os esferóides com 30 μL de anticorpos primários em PBS, 2,5% de FBS e 1% de BSA a 4 ° C durante a noite. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anti-αSMA Cy-3 conjugado e anti-NG2 a 5 μg/mL; BM2 antilaminina α3, 6F12 antilaminina β3 e antilaminina γ2 20 μg/mL.
10. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 1.2-1.3 três vezes.
11. Incubar os esferóides com 30 μL de anticorpos secundários em PBS, 2,5% de FBS e 1% de BSA em RT por 90 min. Os seguintes anticorpos secundários utilizados foram: Alexa 488 anti-coelho e anti-camundongo (5 μg/mL).
12. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 1.2-1.3 três vezes.
13. Incube as células com 30 μL de solução de coloração DAPI por 4 min em temperatura ambiente.
14. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 1.2-1.3.
15. Coloque os esferóides em uma lâmina de vidro, em uma gota de PBS, usando uma pipeta de vidro Pasteur.
16. Visualize os esferoides por microscopia de fluorescência em um microscópio de varredura a laser usando uma ampliação de 10x. Pegue diferentes seções transversais ópticas do esferóide em diferentes planos ópticos de uma pilha z (15-20 planos de pilha). Para estabelecer as configurações do laser no microscópio, use um esferóide composto de células negativas para o antígeno de interesse ou um esferóide corado apenas com o anticorpo secundário. Reutilize as mesmas configurações para todas as amostras que serão comparadas.
17. Analise as imagens microscópicas com o software ImageJ, conforme publicado anteriormente. As etapas estão resumidas na Figura 1. Como pano de fundo, determine a densidade de sinal integrada de uma região de interesse (ROI) livre de células. Calcule a fluorescência celular corrigida total (TCCF) como:
    TCCF = densidade de sinal integrada - (área do esferóide selecionado x fluorescência média do fundo)
18. Determine a fluorescência corrigida total (TCF) dos esferoides à medida que o TCCF normalizou para a área do esferóide e o número de pilhas.
    TCF = TCCF do esferóide / (área dos esferoides x número de pilhas)

Resultados

Figura 1. Etapas sequenciais para quantificação da coloração imunofluorescente de uma proteína de interesse em esferoides, usando ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4',6-Diamidino-2-fenilindo, dicloridrato (DAPI)	SIGMA-ALDRICH	D9542-10
6F12 anti-laminina β3 subunidade Camundongo (monoclonal)			caseiro
Albumina Fração V - BSA	Aplicação	Resposta A1391
Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) anti-mouse	Invitrogen	A11029
Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) Coelho	Invitrogen	A11034
Anti-laminina γ2 subunidade Camundongo (monoclonal)	Santa Cruz	SC-28330
Centrífuga de bancada	Fisher Científico	Telefone: 50-589-620	brotar
BM2 anti-laminina α3 subunidade Camundongo (monoclonal)			Gentilmente cedido pela Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Tubos de centrífuga 50 mL	Corning	Nº 430290
Microscópio confocal	Zeiss
DMEM (glicose alta 4,5 g/L)	Lonza	BE12-604F
Fibroblastos Pancreáticos Primários Humanos	PELOBiotech	PB-H-6201
Penicilina/estreptomicina	Gibco	15140-122
Lâminas de microscópio	Thermo Científico	J1800AMNZ
Paraformaldeído	Riedel-de Haën	Rolamento 16005
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS