Coloração imunofluorescente de esferoides: uma técnica para analisar esferoides quanto à expressão de antígenos intra e extracelulares

- Os esferoides são modelos tridimensionais de cultura de células in vitro. Para coloração imunofluorescente, primeiro, gere uma cultura esferóide do tipo de célula necessário em uma placa multipoços. Usando uma micropipeta com ponta de orifício largo, colete os esferoides, tomando cuidado para evitar a ruptura devido às forças de cisalhamento.

Em seguida, fixe e permeabilize os esferoides para tornar as células individuais permeáveis. Agora, incube com uma solução contendo proteínas para bloquear locais de interação de proteínas não específicas na superfície celular. Trate os esferóides com um coquetel de anticorpos primários desejado. Incube para que os anticorpos se liguem às moléculas-alvo na superfície da célula.

Em seguida, rotule os esferoides com uma solução de anticorpo secundário marcada com fluorescência específica para os anticorpos primários. Finalmente, trate os esferóides com um corante fluorescente de ligação ao DNA adequado para corar os núcleos das células. Usando um microscópio de fluorescência de varredura a laser, obtenha imagens de várias seções transversais ópticas do esferóide em diferentes planos ópticos.

As imagens capturadas refletem núcleos marcados com fluorescência e antígenos de interesse. Mescle as pilhas usando o software relevante para obter a imagem composta final do esferóide 3D. No protocolo a seguir, realizaremos coloração imunofluorescente de esferoides de fibroblastos pancreáticos e fibroblastos associados ao câncer cultivados na presença de um estimulante, TGF beta 1.

- Primeiro, corte a ponta de uma pipeta para ampliar o orifício. Após a conclusão da incubação, use esta ponta de pipeta cortada para coletar os esferóides em um tubo de reação de 1,5 mililitro, por condição experimental ou por proteína a ser analisada. Centrifugue os esferóides a 1.000 vezes g por cerca de 30 a 60 segundos. Remova cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose por pipetagem, certificando-se de não perturbar os esferóides peletizados.

- Deve-se tomar cuidado especial ao transferir os esferóides para os tubos de reação. Certifique-se de não ter forças de tensão de cisalhamento cortando a ponta. Também é importante que você colete todos os esferóides. Durante a etapa de lavagem, certifique-se de não perder os esferoides por aspiração.

- Para lavar os esferóides a 50 microlitros de PBS 1X, centrifugue a 1.000 vezes g por 30 a 60 segundos e, em seguida, remova cuidadosamente o PBS pipetando. Dependendo da proteína a ser corada, fixe os esferóides com 50 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente.

Lave os esferóides com PBS conforme descrito anteriormente. Permeabilize as células com 0,1% de Triton X em PBS por 4 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave os esferóides em PBS três vezes, conforme descrito anteriormente. Adicione PBS contendo 5% de FBS e 2% de BSA aos esferoides e incube em temperatura ambiente por uma hora para bloquear locais de interação de proteínas não específicos.

Agora, incube os esferoides com 30 microlitros de anticorpos primários em PBS com 2,5% de FBS e 1% de BSA a 4 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave os esferoides em PBS três vezes, conforme descrito anteriormente.

Em seguida, incube os esferoides com 30 microlitros de anticorpos secundários em PBS com 2,5% de FBS e 1% de BSA em temperatura ambiente por 90 minutos. Lave os esferóides em PBS três vezes, conforme descrito anteriormente.

Em seguida, incube as células com 30 microlitros de solução de coloração DAPI por 4 minutos em temperatura ambiente. Lave os esferóides em PBS uma vez, conforme descrito anteriormente. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, coloque os esferóides em uma lâmina de vidro em uma gota de PBS. Use um microscópio de varredura a laser para obter imagens dos esferoides por microscopia de fluorescência com uma ampliação de 10 vezes. Pegue diferentes seções transversais ópticas do esferóide em diferentes planos ópticos de uma pilha Z.