Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação para Transplante de Tumor
- Alojamento de animais
- Obtenha camundongos C57BL/6 genéricos de um fornecedor de reprodução comercial.
- Ratos domésticos (5) em gaiolas individuais ventiladas nas seguintes condições: Temperatura: 20-26 °C; humidade 30-70%; ciclo de iluminação: 12 h de luz e 12 h de escuridão.
- Use cama de espiga de milho que é trocada semanalmente.
- Para dieta, forneça alimentos grânulos secos esterilizados por irradiação durante todo o período do estudo.
- Para água, forneça aos animais livre acesso a água potável estéril.
- Preparo de fragmentos tumorais de doadores
- Comece monitorando o peso corporal (PC), por meio de pesagem usando uma balança, e o volume do tumor (VC), por medição de paquímetro, de camundongos doadores portadores de tumor.
- Quando o VC atingir 500–1.200 mm3, sacrificar o animal em um capuz de risco biológico de acordo com o protocolo.
- Esterilize a pele ao redor do tumor usando cotonetes de iodóforo.
- Remova cirurgicamente o tumor de acordo com o protocolo.
- Inspecione visualmente e por palpação a presença de tumores palpáveis antes do término.
- Para a interrupção, primeiro eutanasiar os camundongos de acordo com o protocolo aprovado, abrir o abdômen e examinar visualmente o pâncreas em busca de tumores.
- Corte o tumor por cirurgia pós-mortal e adicione-o ao PBS frio. Coloque todos os animais em uma câmara de eutanásia limpa, sem carga e translúcida com uma tampa especial com uma porta para entrega do dióxido de carbono a ser usado.
- Descarregue o gás na câmara a uma taxa de fluxo que produza inconsciência rápida com o mínimo de sofrimento ao animal. A vazão ideal para CO2 deve ser de cerca de 2–2,5 L/min.
- Observe visualmente cada animal durante o procedimento de eutanásia para garantir que todos os animais recebam concentrações adequadas de gases e não recuperem a consciência durante o procedimento de eutanásia.
- Mantenha o fluxo de gás por pelo menos 1 minuto após a morte clínica aparente para minimizar a possibilidade de um animal se recuperar (se apneico, mas não morto).
- Remova os tecidos não tumorais adjacentes. Tumor limpo pode ser fotografado rapidamente.
Coloque os tecidos tumorais no RPMI-1640 e mantenha no gelo antes da dissociação.
nota: As carcaças de animais são ensacadas e armazenadas no freezer apropriado para aguardar a remoção.
- Coloque o tumor em uma placa de Petri contendo 20 mL de PBS (pré-resfrie o meio ou tampão a 4 ° C antes de sacrificar os animais).
- Se houver sangue contaminante, transfira o tumor para outra placa de Petri e lave o tumor com PBS.
- Corte o tumor ao meio, removendo qualquer pele extra, vasos, calcificação e/ou necrose.
- Escolha apenas pedaços intactos de tumor e coloque-os em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL e adicione 20 mL de PBS e, em seguida, transporte o tubo para uma sala de animais separada para estudos farmacológicos.
2. Implante ortotópico pancreático
- Anestesia e Analgesia
- Use uma injeção de cetamina de 2 mL e uma injeção de xilazina de 0,42 mL (20 mg/mL) misturadas em água de injeção estéril de 5,91 ou solução salina em um volume de dose de 0,06–0,1 mL/20-25 g de peso corporal.
NOTA: De acordo com o bem-estar animal, a analgesia é necessária tanto no pré quanto no pós-operatório. 0,05–0,1 mg de buprenorfina /kg, SC. A primeira dose é pré-operatória e, em seguida, administrada 3 vezes a cada 4 horas após a operação continuamente.
- Operação cirúrgica para implante ortotópico
- Anestesiar camundongos por injeção intramuscular (IM). Anestesiar o animal receptor com isoflurano a 5%, que é mantido por um cone nasal a 1%. O animal começará a relaxar, perdendo o reflexo de endireitamento e, eventualmente, ficará imóvel. Nessa profundidade de anestesia, eles podem ser facilmente despertados por estímulos dolorosos; permitir que a anestesia se aprofunde até que essas respostas à dor estejam ausentes.
- Depois que os animais estiverem totalmente anestesiados, fixe os camundongos em uma placa de experimento na posição lateral direita.
- Mantenha os ratos na posição lateral direita. Desinfete a pele ao redor do baço com iodo e desiodado, em seguida, desiodado, com álcool etílico 75%.
- Encontre o ponto médio do baço e faça uma incisão vertical de 1 cm no abdômen para expor o baço.
- Retire uma parte do tecido do pâncreas sob o baço suavemente com uma pinça de ponta chata e suture um pedaço de tumor de homoenxerto de camundongo no pâncreas do camundongo receptor com sutura cirúrgica absorvível 9-0.
- Feche o abdômen com uma sutura de seda 6-0 por costura dupla. Alcance a homeostase por compressão.
- Após o término da implantação do tumor, se não ocorrer sangramento nem vazamento de tecido tumoral, mantenha os animais em uma gaiola quente.
- Monitore o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal; devolva o animal ao biotério após a recuperação total da anestesia. Monitore os camundongos portadores do tumor palpando o abdômen próximo ao baço e selecione os camundongos portadores de tumores ortotópicos.
3. Monitoramento da saúde de camundongos portadores de tumor
- Verifique o consumo diário de água e alimentos.
- Examine a aparência do rato em busca de uma pelagem descuidada, caroços, magreza, hálito anormal ou ascite.
- Palpe o abdômen para verificar se há tumores espontâneos no fígado ou no baço.
- Pese os ratos semanalmente usando uma balança.
- Se algum dos seguintes sinais clínicos for observado, os camundongos são sacrificados para coleta de amostras e necropsia: perda de peso corporal >20%; mobilidade prejudicada (incapaz de comer ou beber); incapaz de se mover normalmente devido a ascite significativa e abdômen aumentado; esforço na respiração.
