Transplante de tumor ortotópico de homoenxerto: uma técnica para gerar modelos de camundongos com tumor pancreático

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação para Transplante de Tumor

1. Alojamento de animais
   1. Obtenha camundongos C57BL/6 genéricos de um fornecedor de reprodução comercial.
   2. Ratos domésticos (5) em gaiolas individuais ventiladas nas seguintes condições: Temperatura: 20-26 °C; humidade 30-70%; ciclo de iluminação: 12 h de luz e 12 h de escuridão.
   3. Use cama de espiga de milho que é trocada semanalmente.
   4. Para dieta, forneça alimentos grânulos secos esterilizados por irradiação durante todo o período do estudo.
   5. Para água, forneça aos animais livre acesso a água potável estéril.
2. Preparo de fragmentos tumorais de doadores
   1. Comece monitorando o peso corporal (PC), por meio de pesagem usando uma balança, e o volume do tumor (VC), por medição de paquímetro, de camundongos doadores portadores de tumor.
   2. Quando o VC atingir 500–1.200 mm³, sacrificar o animal em um capuz de risco biológico de acordo com o protocolo.
   3. Esterilize a pele ao redor do tumor usando cotonetes de iodóforo.
   4. Remova cirurgicamente o tumor de acordo com o protocolo.
   5. Inspecione visualmente e por palpação a presença de tumores palpáveis antes do término.
   6. Para a interrupção, primeiro eutanasiar os camundongos de acordo com o protocolo aprovado, abrir o abdômen e examinar visualmente o pâncreas em busca de tumores.
   7. Corte o tumor por cirurgia pós-mortal e adicione-o ao PBS frio. Coloque todos os animais em uma câmara de eutanásia limpa, sem carga e translúcida com uma tampa especial com uma porta para entrega do dióxido de carbono a ser usado.
   8. Descarregue o gás na câmara a uma taxa de fluxo que produza inconsciência rápida com o mínimo de sofrimento ao animal. A vazão ideal para CO₂ deve ser de cerca de 2–2,5 L/min.
   9. Observe visualmente cada animal durante o procedimento de eutanásia para garantir que todos os animais recebam concentrações adequadas de gases e não recuperem a consciência durante o procedimento de eutanásia.
   10. Mantenha o fluxo de gás por pelo menos 1 minuto após a morte clínica aparente para minimizar a possibilidade de um animal se recuperar (se apneico, mas não morto).
   11. Remova os tecidos não tumorais adjacentes. Tumor limpo pode ser fotografado rapidamente.
       Coloque os tecidos tumorais no RPMI-1640 e mantenha no gelo antes da dissociação.
       nota: As carcaças de animais são ensacadas e armazenadas no freezer apropriado para aguardar a remoção.
   12. Coloque o tumor em uma placa de Petri contendo 20 mL de PBS (pré-resfrie o meio ou tampão a 4 ° C antes de sacrificar os animais).
   13. Se houver sangue contaminante, transfira o tumor para outra placa de Petri e lave o tumor com PBS.
   14. Corte o tumor ao meio, removendo qualquer pele extra, vasos, calcificação e/ou necrose.
   15. Escolha apenas pedaços intactos de tumor e coloque-os em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL e adicione 20 mL de PBS e, em seguida, transporte o tubo para uma sala de animais separada para estudos farmacológicos.

2. Implante ortotópico pancreático

1. Anestesia e Analgesia
   1. Use uma injeção de cetamina de 2 mL e uma injeção de xilazina de 0,42 mL (20 mg/mL) misturadas em água de injeção estéril de 5,91 ou solução salina em um volume de dose de 0,06–0,1 mL/20-25 g de peso corporal.
      NOTA: De acordo com o bem-estar animal, a analgesia é necessária tanto no pré quanto no pós-operatório. 0,05–0,1 mg de buprenorfina /kg, SC. A primeira dose é pré-operatória e, em seguida, administrada 3 vezes a cada 4 horas após a operação continuamente.
2. Operação cirúrgica para implante ortotópico
   1. Anestesiar camundongos por injeção intramuscular (IM). Anestesiar o animal receptor com isoflurano a 5%, que é mantido por um cone nasal a 1%. O animal começará a relaxar, perdendo o reflexo de endireitamento e, eventualmente, ficará imóvel. Nessa profundidade de anestesia, eles podem ser facilmente despertados por estímulos dolorosos; permitir que a anestesia se aprofunde até que essas respostas à dor estejam ausentes.
   2. Depois que os animais estiverem totalmente anestesiados, fixe os camundongos em uma placa de experimento na posição lateral direita.
   3. Mantenha os ratos na posição lateral direita. Desinfete a pele ao redor do baço com iodo e desiodado, em seguida, desiodado, com álcool etílico 75%.
   4. Encontre o ponto médio do baço e faça uma incisão vertical de 1 cm no abdômen para expor o baço.
   5. Retire uma parte do tecido do pâncreas sob o baço suavemente com uma pinça de ponta chata e suture um pedaço de tumor de homoenxerto de camundongo no pâncreas do camundongo receptor com sutura cirúrgica absorvível 9-0.
   6. Feche o abdômen com uma sutura de seda 6-0 por costura dupla. Alcance a homeostase por compressão.
   7. Após o término da implantação do tumor, se não ocorrer sangramento nem vazamento de tecido tumoral, mantenha os animais em uma gaiola quente.
   8. Monitore o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal; devolva o animal ao biotério após a recuperação total da anestesia. Monitore os camundongos portadores do tumor palpando o abdômen próximo ao baço e selecione os camundongos portadores de tumores ortotópicos.

3. Monitoramento da saúde de camundongos portadores de tumor

1. Verifique o consumo diário de água e alimentos.
2. Examine a aparência do rato em busca de uma pelagem descuidada, caroços, magreza, hálito anormal ou ascite.
3. Palpe o abdômen para verificar se há tumores espontâneos no fígado ou no baço.
4. Pese os ratos semanalmente usando uma balança.
5. Se algum dos seguintes sinais clínicos for observado, os camundongos são sacrificados para coleta de amostras e necropsia: perda de peso corporal >20%; mobilidade prejudicada (incapaz de comer ou beber); incapaz de se mover normalmente devido a ascite significativa e abdômen aumentado; esforço na respiração.