Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária jove.
1. IRE de tumores SQ
- Prepare os materiais necessários: eletroporador de onda quadrada, pedal de segurança, eletrodos (matriz de agulhas versus pinça-trodo) e adaptadores. Mantenha suturas estéreis (não absorvíveis 4-0), compressas com álcool, máquinas de cortar cabelo, creme depilatório, lubrificante para os olhos, gaze de algodão, buprenorfina e anestésicos também por perto.
- Esterilize a pinça ou os eletrodos de matriz de agulhas usando esterilização a gás. A autoclavagem não é recomendada. Use um esterilizador de esferas de vidro para esterilizar os eletrodos entre os animais.
- Siga as etapas para induzir a anestesia com sucesso em camundongos quando o implante tumoral SQ atingir 5 mm de diâmetro. Resumidamente, administre o camundongo receptor 0,05 - 1 mg / kg de buprenorfina analgésico SQ, 30 min antes da cirurgia. Em seguida, anestesiar os camundongos receptores com 2 a 3% de isoflurano em oxigênio (2 L/min) usando um vaporizador de precisão (ou outros agentes anestésicos). Mantenha os ratos numa almofada de aquecimento a 37 °C durante todo o procedimento. Aplique lubrificante nos olhos para evitar a dessecação. Teste a profundidade da anestesia pela falta de reflexo de sobressalto inicialmente e confirme a anestesia do plano cirúrgico pela falta de reflexo do pé para uma pinça suave do dedo do pé. Mantenha a anestesia durante todo o procedimento cirúrgico.
- Coloque o camundongo anestesiado de lado para acessar o tumor SQ no flanco. Remova o cabelo usando uma tesoura e limpe a pele com um cotonete embebido em álcool.
- Para tumores SQ, use eletrodos de matriz de 2 agulhas. Eleve a pele diretamente sob o local do tumor usando uma pinça e insira os eletrodos através da pele paralela ao corpo, certificando-se de que eles não penetrem na cavidade peritoneal. Uma vez através da pele, posicione os eletrodos de forma que eles suportem o tumor.
- Programe o eletroporador para fornecer pulsos de 100 μs a uma frequência de 1 Hz a 1.500 V/cm para um total de 150 pulsos. Forneça os pulsos usando o pedal. Separe cada conjunto de 10 pulsos por 10 s, para permitir a dissipação de calor e confirmar a posição correta dos eletrodos.
nota: Sem o uso de agentes paralisantes, os camundongos experimentarão contrações musculares com IRE que podem causar deslocamento dos eletrodos, a menos que sejam presos manualmente.
- Remova os eletrodos após a dosagem completa, que não deve exceder 200 s. Registre o volume realtage fornecido, que é exibido no eletroporador. Permita que os ratos se recuperem após o IRE em sua gaiola doméstica com livre acesso a comida e água. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento para facilitar a recuperação. Monitore os sinais vitais, como respiração, perfusão, etc., durante o processo de recuperação. Confirme os sinais de reflexo de endireitamento assim que o mouse se recuperar e, em seguida, retorne a lata da gaiola ao alojamento normal. Administre buprenorfina 0,05 - 0,1 mg / kg 8 - 12 h após a cirurgia e a cada 8 - 12 h após o procedimento, conforme necessário para sinais de dor.
2. IRE de tumores ortotópicos
NOTA: IRE de tumores ortotópicos envolve uma segunda cirurgia de sobrevivência no mesmo camundongo, exigindo aprovação especial da IACUC local antes de começar.
- Prepare os materiais necessários: autoclave as ferramentas cirúrgicas, como tesouras, bisturis, chaves de agulha, pinças pontiagudas e pinças de ponta plana. Mantenha também por perto: suturas estéreis (absorvíveis 6-0 e não absorvíveis 4-0), compressas com álcool, máquinas de cortar cabelo, creme depilatório, lubrificante para os olhos, gaze de algodão, solução de iodopovidona a 10%, campos cirúrgicos, almofadas térmicas, eletroporador de onda quadrada, pedal de segurança, eletrodos e seus adaptadores, buprenorfina e anestésicos.
- Avalie os camundongos quanto ao crescimento do tumor ortotópico por imagem de bioluminescência in vivo. Acompanhe o crescimento do tumor por meio de exames de imagem a partir do dia 4 após o implante ortotópico e realize exames de imagem duas vezes por semana. No dia da imagem, administre (injeção intraperitoneal) 30 mg / kg de D-luciferina a um camundongo receptor anestesiado (2 - 3% de isoflurano em oxigênio (2 L / min)) 10 minutos antes da imagem. Imagem para atividade de luciferase usando a configuração de luminescência sem filtros de emissão para uma exposição mínima de 5 s em um gerador de imagens de luminescência com estágio aquecido livre de autofluorescência e mantendo a anestesia para os camundongos.
nota: Os tumores ortotópicos são ideais para o tratamento IRE 8 a 10 dias após o implante, quando os tumores são claramente visíveis e ainda confinados ao pâncreas, como pode ser visto nas imagens de luminescência da luciferase
- Siga as etapas para localizar o tumor implantado. Resumidamente, administre ao camundongo receptor 0,05 - 1 mg / kg de buprenorfina analgésico SQ, 30 min antes da cirurgia. Anestesiar os camundongos receptores com 2 a 3% de isoflurano em oxigênio (2 L / min) usando um vaporizador de precisão (ou outros agentes anestésicos). Mantenha os ratos numa almofada de aquecimento a 37 °C durante todo o procedimento. Aplique lubrificante nos olhos para evitar a dessecação. Teste a profundidade da anestesia pela falta de reflexo de sobressalto inicialmente e confirme a anestesia do plano cirúrgico pela falta de reflexo do pé para uma pinça suave do dedo do pé. Mantenha a anestesia durante todo o procedimento cirúrgico. Coloque o mouse de costas e vire-o suavemente para o lado direito para que o lado esquerdo do abdômen fique exposto. Remova os pelos abdominais do camundongo usando creme depilatório e limpe com gaze para garantir que nenhum cabelo livre entre no abdômen após a incisão. Prepare o abdômen esquerdo para a cirurgia usando 3 ciclos de iodopovidona a 10% seguidos de lenços umedecidos com álcool para desinfetar a pele. Usando um bisturi estéril, faça uma incisão transversal ou oblíqua de 1,5 cm na pele, 1 cm à esquerda da linha média, abaixo da caixa torácica, ligeiramente medial ao baço. Em seguida, estenda a incisão através da musculatura abdominal, espelhando a incisão superficial sobrejacente. Localize o baço usando uma pinça de ponta chata e exteriorize-o suavemente da cavidade abdominal. Retraia o baço usando um aplicador de algodão estéril e encontre a cauda do pâncreas presa à parte inferior do baço. Usando uma pinça de ponta chata, retraia a cauda do pâncreas lateralmente. Se o tumor não for fácil de localizar, use uma pinça de nariz rombudo para mover o estômago e o baço suavemente para identificar o tumor.
- Externalize o tumor com uma pinça de ponta romba e capture o tumor firmemente com os eletrodos de platina da pinça. Forneça os pulsos de eletroporação conforme programado na etapa 1.7 usando o eletroporador de onda quadrada em conjuntos de 10 pulsos controlados pelo pedal.
- Mantenha o tumor externalizado por pelo menos 60 s após o IRE para monitorar quaisquer sinais de hemorragia. Insira o tumor de volta na cavidade abdominal e feche a incisão conforme descrito. Resumidamente, feche a musculatura abdominal usando uma sutura absorvível 6-0 com um ponto contínuo ou interrompido e feche a pele sobrejacente usando uma sutura interrompida não absorvível 3-0 a 6-0. Interrompa a anestesia neste momento. Permita que o mouse se recupere conforme descrito em 1.7. Monitore o mouse até que ele se recupere.
- Monitore os efeitos do IRE no crescimento do tumor usando imagens de luciferase in vivo de acordo com a etapa 2.2.
