Co-culturas de esferóides 3D magneticamente bioimpressas: um método para co-cultura de células cancerígenas e fibroblastos

Resumo

Fonte: Noel P. et al.Preparação e Ensaio Metabólico de Co-culturas de Esferóides Tridimensionais de Células de Câncer de Pâncreas e Fibroblastos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo explica a bioimpressão magnética 3D de células cancerígenas pancreáticas e fibroblastos co-cultivados. As células cancerígenas pancreáticas e as células de fibroblastos pancreáticos ativadas são co-cultivadas e magnetizadas usando um conjunto de nanopartículas biocompatível, para gerar esferoides, sob a influência de forças magnéticas.

Protocolo

1.Cultura de esferoides 3D de câncer de pâncreas usando bioimpressão magnética

1. Usando a técnica padrão de cultura de tecidos assépticos, cultive células de interesse em um frasco T75 para uma confluência de 70-80% em meios de crescimento apropriados.
   nota: Normalmente, 5-7 × 10⁶ células de um frasco T75 confluente de 70-80% foram colhidas. Dois tipos diferentes de células foram usados neste estudo - Patu8902 (células tumorais pancreáticas) e células PS1 (células estreladas pancreáticas ativadas). Ambas as linhagens celulares foram cultivadas em Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 1× penicilina-estreptomicina (p/s).
2. Lave as células uma vez com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).
3. Separe as células da superfície plástica tripsinizando com 2 mL de tripsina-EDTA a 0,05% por 5-10 min a 37 ° C. Verifique o descolamento das células ao microscópio.
4. Desative a tripsina pela adição de 8 mL de meio de crescimento às células destacadas. Evite a tripsinização excessiva, pois isso pode afetar adversamente a saúde / viabilidade das células.
5. Pipet células para cima e para baixo para gerar uma única suspensão celular e contar a densidade celular usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro.
6. Enquanto isso, equilibre um frasco de NS à temperatura ambiente.
7. Calcule a quantidade de células necessárias para semear o número desejado de esferóides (poços) e alíquota para um novo tubo cônico de 15 mL. Por exemplo, para semear uma placa inteira de 96 poços com 5.000 células/poço, alíquota de pelo menos 5,5 × 10⁵ células.
8. Colete as células centrifugando a 500 x g por 3 min. Cuidadosamente aspirado ou decantador o sobrenadante e ressuspenda as células a uma concentração de 1,0 x 10⁶ células / mL em meio de crescimento. Pipete suavemente usando uma ponta de pipeta larga e furada para evitar cisalhamento. Por exemplo, ressuspenda 5,5 x 10⁵ células em 550 μl de meio de crescimento.
9. Magnetize a quantidade desejada de células usando o NS equilibrado (etapa 1.6).
   1. Adicione diretamente NS à suspensão celular em meio de crescimento e agite suavemente. Para uma marcação magnética eficiente das células, use 10 μL de NS por células de 100 μL (ressuspensas a 1 x 10⁶ células/mL).
      nota: Para um experimento típico, rotule 5,5×10⁵ células Patu8902 em 550 μL com 55 μL NS e 1,1×10⁶ células PS1 em 1100 μL, (separadamente) com 110 μL NS.
   2. Inverta suavemente o tubo algumas vezes para garantir a suspensão da célula. Temporariamente, transfira a mistura célula-NS para um único poço de uma placa de 24 poços. Faça isso separadamente para cada tipo de célula a ser magnetizada. Cubra a placa e incube as células à temperatura ambiente por 2 h com agitação suave para permitir a ligação do NS à superfície da célula.
      nota: A cultura e o ensaio de esferoides a partir de células Patu8902 ou PS1 isoladas, além de esferóides de co-cultura começando com ambos os tipos de células pré-misturadas antes da impressão em unidades magnéticas, foram alcançados com sucesso usando este método em experimentos independentes. Um método para gerar esferóides de co-cultura a partir de células Patu8902 e PS2 é descrito abaixo nas etapas subsequentes.
10. Pipet para cima e para baixo nas células magnetizadas suavemente para misturar uniformemente e preparar uma mistura mestre contendo o número de células desejado. Para semear esferoides, use um total de 15.000 células (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) e ajuste para um volume total de 150 μL por poço de uma placa de 96 poços.
    nota: O volume final dispensado em cada poço deve ser o mesmo, independentemente do número de células utilizadas.
11. Coloque uma placa repelente de células de 96 poços no topo da unidade esferóide magnética de 96 poços e dispense 150 μL de mistura de células em cada poço. Observe as células se acumulando lentamente no centro do poço acima do ímã. Cubra e incube a placa durante a noite em uma incubadora de CO_{5% 2} ajustada a 37 ° C com o acionamento esferóide magnético ainda conectado. Remova a unidade magnética e incube para crescimento adicional por até 7 dias.
    nota: É fundamental usar placas de crescimento repelentes de células para impressão de esferóides usando unidades esferóides magnéticas. Certifique-se de que a unidade esferóide com ímãs menores mais finos seja usada, não a unidade de retenção.
12. Monitore o crescimento de esferóides todos os dias. Reabasteça com meios de crescimento novos a cada três dias, colocando a placa de crescimento montada na unidade de retenção magnética em um ângulo e usando uma pipeta multicanal para extrair o meio gasto.
    nota: As células Patu8902 e PS1 co-semeadas em 15.000 células/poço crescerão em esferóides 3D com um diâmetro de 400-600 μm dentro de 5-7 dias. Neste ponto, os esferoides estão prontos para caracterização metabólica, avaliação de medicamentos e outras aplicações a jusante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% de tripsina EDTA	sigma	Rolamento 25300-054
Placa repelente de células de 96 poços	EUA Scientific/ Griener Bio-One	Nº 655970	placa de crescimento esferóide
Celularidade Lâminas de contagem de células	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Unidade esferóide magnética n3D	Biociência Nano3D	655841	Parte do kit de bioimpressão esferóide
n3D Esferóide Magnético holding Dirigir	Biociência Nano3D	655841	Parte do kit de bioimpressão esferóide
n3D NanoShuttle-PL	Biociência Nano3D	655841	Parte do kit de bioimpressão esferoidal: Conservar a 4 °C
Células Patu8902	Estoque de Laboratório		Adenocarcinoma ductal pancreático Células
Células PS1	Estoque de Laboratório		células estreladas pancreáticas ativadas
RPMI1640	Gibco	11875-093	meios de crescimento para células, esferóides