1. Ensaio Metabólico de Esferóides de Tumor Pancreático 3D para Vias Bioenergéticas usando o Analisador de Fluxo Extracelular
NOTA: Nesta seção, é descrita a análise das funções metabólicas dos esferoides usando um analisador de fluxo extracelular com microplacas de ensaio projetadas especificamente para esferoides 3D.
- Lavagem e transferência de esferoides de placas de crescimento para microplacas de ensaio de esferoides.
nota: Os esferóides podem ser usados para ensaios metabólicos quando atingem um diâmetro de ~ 500 μm.
- No dia anterior à realização do ensaio, hidrate a sonda ou o cartucho do sensor com o calibrante do ensaio (200 μL/poço) na placa de utilidade fornecida e incube durante a noite (4-18 h) em uma incubadora umidificada (não-CO2) ajustada para 37 °C.
- Prepare o meio de ensaio apropriado para o ensaio metabólico desejado suplementando o meio de base (consulte a Tabela de Materiais) com 2 mM de L-glutamina para o ensaio de teste de estresse de glicólise (GST) ou com 1 mM de piruvato, 2 mM de L-glutamina e 10 mM de glicose para um ensaio de teste de estresse mitocondrial (MST).
nota: O analisador de fluxo extracelular mede a respiração mitocondrial (OCR) e a glicólise (ECAR) de células vivas em um formato de placa de 96 poços. Essas taxas fornecem uma visão geral da função metabólica celular nas amostras sob investigação. Consulte o manual nos kits de ensaio para obter instruções detalhadas.
- Depois de adicionar suplementos específicos do ensaio (consulte a Etapa 1.1.1), aqueça o meio de ensaio suplementado em banho-maria a 37 ° C e ajuste o pH para 7,4 ± 0,1 com NaOH 0,1N. Mantenha o meio aquecido até o uso.
- Reconstituir os reagentes do kit de ensaio no meio de ensaio calibrado para as concentrações de estoque recomendadas.
nota: Estes são feitos a 10× da concentração final desejada nos poços. As concentrações de estoque para glicose, oligomicina e 2-desoxi-glicose (2-DG) são 100 mM, 100 μM e 500 mM, respectivamente.
- Observe os esferóides na placa de crescimento sob um microscópio óptico para verificar a morfologia dos esferóides e a uniformidade geral; em termos de forma e estrutura dos esferoides.
- Transfira a placa de crescimento para uma unidade de retenção magnética e aspire cuidadosamente o meio de crescimento de ~ 120 μL. Lave suavemente os esferóides com ~ 120 μL de meios de ensaio aquecidos e pré-calibrados, aspire e repita a lavagem duas vezes. Inspecione os esferoides sob o microscópio novamente para garantir que os esferoides não sejam lavados.
- Prepare a microplaca de ensaio esferóide adicionando 180 μL de meio de ensaio quente a cada poço.
- Defina uma micropipeta P20 para 10 μL e encaixe uma ponta larga e furada nela. Se as pontas largas e furadas não estiverem disponíveis, corte as pontas das pontas da pipeta comum com uma tesoura limpa ou bisturi para alargar o furo.
nota: Isso deve reduzir o cisalhamento e preservar a morfologia geral dos esferoides enquanto são transferidos para placas de ensaio.
- Use uma superfície quente (37 ° C) para realizar a transferência de esferóides. Use uma superfície de visualizador de filme de raios-X aquecida com uma lâmpada de luz branca para melhorar o contraste e ajudar na visualização de esferoides durante o processo de transferência.
- Aspire cuidadosamente um único esferóide pré-lavado da placa de crescimento repelente de células usando uma micropipeta P20 equipada com uma ponta de furo largo e transfira suavemente o esferóide diretamente para o centro de cada poço de uma placa de ensaio esferóide para realizar o ensaio metabólico. Permita que cada esferóide caia suavemente na microcâmara central de cada poço por gravidade pura para preencher a placa de ensaio.
nota: Geralmente, leva de 5 a 8 s para cada esferóide cair no centro do poço por gravidade. Não retire a pipeta até que os esferóides tenham se acomodado na microcâmara. Não deposite esferóides nos 4 poços de canto da placa de ensaio (A1, A12, H1, H12), pois eles serão usados como poços de fundo.
- Monitore a morfologia e a posição de cada esferóide para garantir que cada esferóide esteja no centro de cada poço. Se necessário, reposicione no centro do poço aspirando o esferóide usando uma ponta de pipeta de diâmetro largo e subsequente deposição por gravidade.
- Uma vez que todos os esferóides tenham sido transferidos, coloque a placa de ensaio em uma incubadora de ar umidificado a 37 ° C (não-CO2) por uma hora antes do ensaio.
- Carregar o cartucho do sensor com compostos e realizar o ensaio
- Preparar 10× reagentes específicos concentrados para ensaio nos meios específicos para ensaio descritos no passo 1.1.2. Por exemplo, para realizar o GST, reconstitua glicose, oligomicina e 2-DG nos volumes recomendados referidos no manual do ensaio. Os ensaios GST e MST foram realizados usando esferóides Patu8902-PS1.
- Oriente corretamente o cartucho do sensor com as linhas rotuladas como AH no lado esquerdo e coloque uma guia de carregamento na parte superior do cartucho do sensor. Garanta o carregamento correto da porta desejada orientando a guia de carregamento de forma que a letra correspondente à porta a ser carregada fique no canto superior esquerdo.
- Usando uma pipeta multicanal, dispense os reagentes diretamente nas portas de injeção. Segure as guias de carregamento na posição usando as pontas dos dedos durante todo o procedimento.
nota: Cada reagente será injetado em uma porta recomendada referida no manual do ensaio. Evite criar bolhas de ar, mas não bata em nenhuma parte do cartucho para remover bolhas de ar.
- Remova a guia de carregamento e posicione-a ao nível dos olhos com o cartucho para inspecionar visualmente as portas de injeção para um carregamento uniforme.
- Crie o projeto de ensaio experimental/protocolo do instrumento usando o software Wave do controlador do instrumento (doravante, software de análise) conforme descrito na seção 1.3.
- Projeto e execução do ensaio usando o software de análise
- Crie um modelo de ensaio para o experimento
- Abra o software de análise e clique em "Modelos" ou escolha um modelo de ensaio existente. Clique duas vezes em "Modelo em branco".
- Definir grupos e condições experimentais.
- Defina estratégias de injeção para as portas A, B e C. Deixe a porta D vazia.
nota: Para o ensaio GST, apenas essas portas serão carregadas com glicose, oligomicina e 2-DG. No caso do ensaio MST, oligomicina, FCCP e rotenona serão carregados.
- Defina os pré-tratamentos se os esferoides foram tratados com um ou mais compostos de teste e o grupo de controle. Defina o meio de ensaio para incluir fonte, suplementos e outras informações.
- Defina um ou mais tipos de célula (por exemplo, Patu8902, PS1) vendo as informações de densidade e número de passagem.
- Clique em "Gerar grupos".
- Clique na guia "Mapa de placas" e atribua grupos à placa de ensaio correspondente ao projeto experimental.
- Selecione os quatro poços de canto como poços de fundo. Certifique-se de que não haja esferoides nesses poços.
- Execute o ensaio no analisador
- Clique na guia Protocolo do instrumento. Mantenha os comandos de protocolo padrão marcando "Calibrar", "Equilibrar" e "Ciclo de medição da linha de base".
- Clique em "Injeções" e defina o composto para cada porta. Edite os ciclos de medição para 6 ciclos a partir dos 3 ciclos padrão para esferoides. Mantenha os tempos padrão de mixagem de 3 minutos, espera de 0 min e medição de 3 min.
nota: Os tempos padrão de mix-wait-measure são 3 min, 0 min, 3 min, respectivamente. Três medições da taxa basal são normalmente feitas antes da injeção do primeiro composto de ensaio. Essas medições podem ser calibradas e reajustadas de acordo com o projeto experimental.
- Revise o protocolo e o resumo do grupo.
- Salve o modelo de design de ensaio.
- Prossiga para a calibração pré-ensaio assim que as portas de injeção forem carregadas com substratos de ensaio. Transfira o cartucho com a placa de utilidade para o analisador de fluxo extracelular.
nota: Isso geralmente é concluído em 15 a 20 minutos e calibra os sensores para realizar medições de OCR e ECAR.
- Após a calibração do cartucho, substitua a placa de utilidade pela placa de ensaio pré-aquecida contendo esferóides 3D e inicie o ensaio. Após a conclusão das medições, exporte os dados para planilha ou software gráfico e estatístico para analisar os dados.
