Modelo de camundongo ortotópico fluorescente: implantando células cancerígenas que expressam GFP em camundongos para avaliar a progressão do tumor in vivo

Resumo

Fonte: Moreno, J. A., et al. Modelo de camundongo ortotópico fluorescente de câncer de pâncreas. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o protocolo para implantar células cancerígenas pancreáticas que expressam proteínas fluorescentes verdes ortotopicamente no pâncreas do camundongo. O modelo ortotópico de camundongo ajuda a investigar a eficácia de novas terapêuticas em tumores primários e metastáticos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária jove.

1. Implante Cirúrgico

NOTA: Certifique-se de que todos os materiais e instrumentos cirúrgicos sejam estéreis. Pratique técnicas assépticas em todos os momentos.

1. Coloque uma almofada de aquecimento sobre a mesa e cubra com uma cortina estéril. Configure a máquina de anestesia e certifique-se de que todos os suprimentos estejam ao alcance do braço.
2. Coloque o focinho do animal na máscara de anestesia e configure a anestesia para 1 L/min de oxigênio e 2,5% de isoflurano.
3. Esfregue suavemente o flanco do animal com iodo e enxágue com etanol a 70%. Repita três vezes.
4. Confirme se o animal está totalmente anestesiado beliscando a pata traseira. O animal está totalmente anestesiado e pronto para a cirurgia se nenhuma resposta for observada. No entanto, se o animal recuar, certifique-se de que haja anestesia suficiente no vaporizador e permita que o animal tenha mais tempo para ficar completamente sob anestesia.
5. Carregue aproximadamente 200 μl da suspensão celular em uma seringa de 1,0 ml TB com uma agulha de 18 G (previamente resfriada). Substitua a agulha por uma agulha de 27 G e volte ao gelo até a hora de usar.
6. Localize a área geral do baço (quadrante superior esquerdo do abdômen) e, usando uma pinça, aperte a pele em cima dessa região. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de aproximadamente 1,0 cm para criar uma bolsa. Da mesma forma, aperte o músculo liso na parte superior do baço e corte para acessar a cavidade peritoneal.
7. Agarre suavemente a extremidade caudal do baço e puxe-a para fora do corpo. O pâncreas ficará ligado ao baço. Espalhe o pâncreas usando um cotonete estéril úmido e localize a cauda do pâncreas.
8. Administre a injeção de 50 μl na cauda do pâncreas, deixe a agulha dentro por 10 segundos e gire lentamente a agulha para fora do pâncreas. Uma implantação bem-sucedida parecerá uma bolha superficial sem vazamentos.
9. Retorne o pâncreas e o baço para a cavidade peritoneal. Primeiro envolva o músculo e depois envolva a pele separadamente. Use uma sutura ou grampo 6-0 para fechar a incisão. Para evitar dor no animal, administre cetoprofeno por via subcutânea (SC) (5 mg / kg) durante 24 horas. Alternativamente, administre buprenorfina sc (0,05 - 0,1 mg / kg) a cada 12 horas durante um período de 36 horas.
10. Recupere o animal da anestesia e devolva-o à sua gaiola. Monitore também a dor. Os animais devem receber alívio da dor no momento da cirurgia (ou mesmo antes - preventiva). Alívio adicional da dor deve ser fornecido aos animais que sentem dor de acordo com o protocolo IACCUC ou conforme prescrito pelo veterinário assistente ou designado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alcare ou espuma anti-séptica para as mãos	Steris	Nº 639680
Seringa TB 27 G 1/2	Becton Dickinson	Rolamento 305620
Isoflurano	Blutler Schein	Rolamento 50562
Cetoprofeno	Saúde Animal Fort Dodge
Tesoura cirúrgica, maionese reta de 5,5"	Henry Schein	22-1600
Linha celular PANC-1 GFP	Anticâncer, Inc
Sistema de imagem de pequenos animais: iBox Scientia	UVP, LLC. Planalto, Califórnia.		Sistema de imagem de pequenos animais para observar o tumor fluorescente em animais vivos
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Linha celular PANC-1 GFP	Anticâncer, Inc
DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dubelcco)	Thermo Ficher Sci	21300025