Isolamento de células-tronco PDAC: um método para isolar células-tronco cancerígenas de tumores pancreáticos

Resumo

Fonte: Lonardo, E., et al. Estudando as características das células-tronco do câncer de pâncreas para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento. J. Vis. Exp. (2015).

Este artigo descreve a técnica para isolar células-tronco de câncer de pâncreas (CSCs) do tecido de adenocarcinoma ductal pancreático humano (PDAC). Essas CSCs são usadas para estudar os efeitos funcionais do tratamento medicamentoso na capacidade de auto-renovação in vitro das CSCs para o desenvolvimento de tratamentos de câncer mais eficientes.

Protocolo

1. Isolamento de CSCs de PDAC humano (Figura 1)

1. Em um gabinete de biossegurança estéril, transfira o tecido PDAC humano para uma placa de cultura de 60 x 15 mm contendo 1 ml de solução salina estéril 1X tamponada com fosfato (PBS). Pique o tumor em pequenos pedaços (1 - 5 mm) usando um bisturi estéril e uma pinça.
2. Adicione 1 ml de PBS 1X estéril à placa de cultura e repita a etapa de trituração até que o tecido esteja completamente dissociado, regularmente isso requer 3-4 rodadas. Transfira a suspensão de tecido (complete até um volume final de 5 ml com 1X PBS) para um tubo estéril e homogeneize-o mecanicamente com um dissociador como gentleMACS.
3. Incubar o tecido homogeneizado com colagenase (utilizar 2,5 mg/ml de colagenase em PBS 1X) durante 60 min a 37°C e depois centrifugar durante 5 min a 900 x g. Transvasar o sobrenadante e ressuspender os sedimentos celulares em 10 ml de meio completo. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de 40 μm e centrifugar durante 5 min a 900 x g.
4. Transvasar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 5 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos (cloreto de amónio-potássio, ACK) e incubar o
5. Ressuspenda o pellet em meio CSCs, coloque em um prato revestido de gelatina e incube a 37 ° C por 1 h. Esta etapa removerá a maioria das células de fibroblastos que se ligam rapidamente à placa.
6. Remova a placa da incubadora e recupere cuidadosamente a suspensão celular e quantifique o número de células viáveis (azul de tripano negativo) usando um hemocitômetro. Para isso, misture suavemente a suspensão e pipete 20 μl da suspensão em um tubo Eppendorf. Adicione 20 μl (proporção de 1:1) de azul de tripano às células do tubo de microcentrífuga e misture bem. Pipetar aproximadamente 10 μl da mistura para o hemocitómetro.
7. Conte todas as células claras dentro dos quatro quadrantes de canto da câmara de contagem para contagem de células viáveis.
   nota: A viabilidade e o rendimento das células podem variar consideravelmente entre as amostras de tumor. Para amostras de PDAC, a viabilidade varia regularmente entre 45-70%, e pedaços de tecido de uma amostra de tumor macroscópico com um diâmetro de 3 a 5 mm devem render aproximadamente 5x10⁶ células viáveis.

Resultados

Figura 1. A metformina visa seletivamente os CSCs.
(A) A metformina diminuiu o tamanho das esferas. Imagens representativas de esferas obtidas após o tratamento com as doses indicadas de metformina por 7 dias (painel direito). Quantificação do tamanho da esfera (n≥6) (painel esquerdo), os números indicados no eixo das abscissas representam o tumor individual. (B...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara de Contagem/ Hemocitômetro	Hausser Scientific Co	3200
Contador e analisador de células CASY para medição de proliferação e viabilidade	Roche Innovatis	Modelo AG CASY TTC 45,60,150 μm
Dissociador GentleMACS	Miltenyi Co	130-093-235
Tubos GentleMACS C	Miltenyi Co	130-093-237
Placas de cultura de tecidos de 100 mm	Falcão BD	353803
Filtro de células	Falcão BD	Rolamento 352350
Tubo cônico de polipropileno de 15 ml	Falcão BD	352097
Tubo cônico de polipropileno de 50 ml	Falcão BD	Rolamento 352070
Tubos estéreis de 1,5 ml	Eppendorf	Nº 0030 120.086
Tubos de centrífuga de 50 ml	Corning	430828
Placas de Petri estéreis, placas de 10 cm	Corning	353003
Colagenase tipo IV	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 7909
RPMI Médio 1640	Tecnologias de vida	11875-085
Solução de penicilina/estreptomicina, 100X	Tecnologias de vida	SV30010
L-glutamina, 200 mM, 100X	Tecnologias de vida	Rolamento 25030-081
Suplemento B27 50x	Tecnologias de vida	Rolamento 17504-044
Fator de crescimento básico de fibroblastos	sigma	F0291
Eagle Modificado Meio / F12 de Dulbecco	sigma	D8437
Estéril 1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	sigma	D8537
Azul Trypan	Tecnologias de vida	Rolamento 15250-061
Incubadora com entrada de CO2
Micro tesoura
Pinça curva
Pinça de lasca