Ensaio de formação de esferas: um método in vitro para identificar células-tronco de câncer de pâncreas e terapias de triagem

Resumo

Fonte: Lonardo, E. et al. Estudando as características das células-tronco do câncer de pâncreas para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra o protocolo para o desenvolvimento de esferoides de células-tronco de câncer de pâncreas in vitro. O ensaio pode servir como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que potencialmente têm como alvo as células-tronco cancerígenas.

Protocolo

1.Ensaio e Análise de Formação de Esferas

1. Ensaio de formação de esferas e tratamento com metformina
   1. Pegue o número necessário de células e adicione o volume apropriado de meio CSCs para preparar uma concentração celular de 2.000 células / ml. Não mantenha a suspensão celular no gelo por não mais de 1h e misture bem antes do revestimento.
   2. Adicione 500 μl de PBS 1X à primeira e última fileira de uma placa de 24 poços para umidificação, a fim de ajudar a minimizar a evaporação do meio. Semeie as células em placas de células de fixação ultrabaixa a uma densidade de 2.000 células por poço em 1 ml de meio de esfera tumoral (2.000 células/ml).
      nota: O número de células usadas para ensaios de formação de esferas tumorais pode variar entre os tipos de tumor.
   3. Trate pelo menos 4 alvéolos com veículo (controlo negativo) e 4 alvéolos com cada tratamento atribuído, por exemplo, 3 mM de metformina. Colocar as células em uma incubadora ajustada para 37 °C e fornecer às células 5% de CO₂ por uma semana.
      nota: O meio não deve ser alterado para permitir a formação não perturbada de esferas tumorais, mas pode ser complementado com fatores de crescimento diariamente, pois não são estáveis no meio de cultura.
   4. A cada dois dias, adicione tratamento, por exemplo, 3 mM de metformina ou veículo a cada um dos poços. Avaliar o número de esferas tumorais formadas após 5 e/ou 7 dias pelo uso de um contador de células automatizado que permite a contagem de estruturas maiores (Figura 1).
      nota: Apenas esferas tumorais com pelo menos 40 μm devem ser consideradas e podem ser categorizadas como pequenas (40 - 80 μm) ou grandes (80 - 120 μm), respectivamente. Os resultados podem ser ilustrados como a porcentagem de esferas tumorais dividida pelo número inicial de células semeadas (por exemplo, 2.000 células).
2. Passagem em série de esferas tumorais de primeira geração
   1. Após 7 dias de incubação, colha as esferas tumorais usando um filtro de células de 40 μm e centrifugue-as por 5 min a 900 x g em RT.
   2. Dissocie o pellet de esferas tumorais em células únicas usando tripsina e, em seguida, expanda a suspensão de células unicelulares obtidas novamente por mais 7 dias.

Resultados

Figura 1. O tratamento com metformina inibe o consumo de oxigênio e induz a produção de ROS. (A) A adição de metformina inibe o consumo de oxigênio (OCR) de células derivadas de esferas. Duas esferas secundárias diferentes de PDAC foram tratadas com metformina e as alterações do OCR foram medidas por análise de fluxo extracelular. A injeção de rotenona foi usada com...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de fixação ultrabaixa de 24 poços	Corning	3474
Estéril 1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	sigma	D8537
Metformina	sigma	D150959-5G
Solução de tripsina, 0,05%	Tecnologias de vida	25300054
Incubadora com entrada de CO2
Contador e analisador de células CASY para medição de proliferação e viabilidade	Roche Innovatis	Modelo AG CASY TTC 45,60,150 μm
Câmara de Contagem / Hemocitômetro	Hausser Scientific Co	3200
Tubos de centrífuga de 50 ml	Corning	430828
Tubo cônico de polipropileno de 15 ml	Falcão BD	352097
Tubo cônico de polipropileno de 50 ml	Falcão BD	Rolamento 352070