Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Ressonância Magnética
- Aplique a ressonância magnética quando o tamanho do tumor for de cerca de 5 a 7 mm de diâmetro, geralmente 2 ~ 4 semanas após a implantação da célula. Use um scanner de RM dedicado a imagens de pequenos animais ou um scanner de RM clínico equipado com uma bobina especializada para imagens de pequenos animais.
nota: Usamos um scanner de RM de pequenos animais 9.4T com uma combinação de um ressonador/transmissor de volume de 1H e um receptor de bobina de superfície (30 mm de diâmetro) (Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA). Uma bobina de superfície fornece melhor relação sinal-ruído (SNR).
- Prepare um agente de contraste de ressonância magnética à base de gadolínio para injetar ~ 0,1 - 0,2 mmol / kg em cada animal em ~ 0,1 - 0,2 ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato).
nota: Usamos gadoteridol e injetamos 0,2 mmol/kg em 0,15 ml de PBS durante um período de 15 segundos (0,1 ml/s).
- Prepare um tubo de micropolietileno (comprimento: 7,62 mm, diâmetro interno: 0,28 mm, diâmetro externo: 0,64 mm). Insira uma agulha de 30 G (12,7 mm de comprimento) em uma extremidade do tubo e uma agulha de ponta romba de 30 G (9,5 mm de comprimento) na outra extremidade. Conecte uma seringa de 1 ml contendo agente de contraste MR à agulha de ponta romba e empurre lentamente a seringa para encher todo o tubo com o agente de contraste MR.
- Anestesiar os animais usando ventilação com ~ 1 - 2% de isoflurano misturado com oxigênio (2 L / min) durante a preparação e imagem. Confirme a profundidade da anestesia pelo reflexo de pinça do dedo do pé. Aplique pomada oftálmica veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Dilate a veia da cauda usando uma lâmpada de calor antes da inserção da agulha. Pegue o meio da agulha de 30 G usando uma pinça Kelly e insira-a na veia da cauda. Cole a cauda e o tubo em um pedaço de papel plástico ou papelão (10 mm de largura x 100 mm de comprimento) para manter a cauda reta.
- Coloque o animal em decúbito dorsal em uma cama de animais equipada com água morna circulante (ou ar quente) para regular a temperatura corporal durante a imagem. Defina a temperatura na cama para 37 °C. Insira uma sonda de temperatura retal para monitorar a temperatura corporal durante a imagem.
- Aplique uma placa de plástico dobrada ortogonalmente na área abdominal. Certifique-se de que o tumor esteja localizado atrás da extremidade superior da placa e, em seguida, puxe a placa ligeiramente para baixo (~ 2 mm) para garantir que o tumor seja capturado pela placa. Prenda a placa com fita adesiva na cama dos animais.
- Cole um transdutor de almofada de respiração (SA Instrument, Inc., Stony Brook, NY) na área do tórax para monitorar a respiração do animal durante a imagem. Coloque uma bobina de superfície no topo da região do tumor e prenda-a firmemente na cama do animal. Empurre o leito do animal para dentro do scanner de ressonância magnética para colocar a região do tumor no centro da bobina de volume (diâmetro interno: 72 mm).
- Execute a correspondência e a sintonia para o receptor e o transmissor, seguido de calço.
- Comece com uma sequência anatômica de ressonância magnética para localizar o tumor. Use uma sequência spin-eco turbo ponderada em T2 (T2W) para obter imagens axiais com os seguintes parâmetros de aquisição. Tempo de repetição (TR)/tempo de eco (TE) = 3.000/34 mseg, matriz 128 x 128, campo de visão de 30 x 30 mm, número de médias = 1, comprimento do trem de eco = 4 e 20 cortes contíguos de 1 mm de espessura em modo entrelaçado para cobrir toda a região do tumor (tempo total de varredura: 1,6 min).
nota: Como os tumores pancreáticos ortotópicos são mais difíceis de serem localizados do que os subcutâneos, as imagens localizadoras convencionais com resolução mais baixa podem não ser úteis.
- Adquira imagens ponderadas em T1 (T1W) com vários ângulos de inversão para recuperar o mapa T1. Para isso, use uma abordagem de ângulo multiflip gradiente eco com os seguintes parâmetros: tempo de repetição (TR)/tempo de eco (TE) = 115/3 mseg, matriz de 128 x 128, um campo de visão de 30 x 30 mm, número de médias = 4, ~ 5 - 7 cortes contíguos de 1 mm de espessura em um modo entrelaçado para cobrir a região do tumor e sete ângulos de inversão de 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70 (tempo total de digitalização por ângulo de inversão: 1 min).
nota: No entanto, a abordagem de ângulo multiflip é eficiente apenas quando a homogeneidade do campo B1 é alta. Caso contrário, os mapas T1 podem ser obtidos com várias abordagens TR.
- Adquira imagens T1W antes e depois da injeção de contraste de RM à base de gadolínio. Use os mesmos parâmetros de aquisição e geometria para o mapeamento T1, mas com o ângulo de inversão fixo de 30. Use a codificação linear para garantir o estado estacionário quando o centro do espaço k for obtido, especialmente quando um TR curto e um ângulo de inversão de baixo grau forem usados. Adquira 5 imagens de linha de base antes da injeção de contraste. Em seguida, adquira 40 imagens após a injeção de contraste (tempo total de digitalização: 45 min). Use uma bomba de seringa para injetar o agente de contraste a uma taxa constante (0.01 ml/seg).
- Monitore a respiração do animal continuamente e ajuste a concentração de isoflurano para manter a frequência respiratória em 50 a 100 respirações por minuto. Monitore a temperatura corporal do animal durante a imagem.
- Depois de completar a DCE-MRI, retire a agulha e outras sondas e coloque o animal em uma gaiola vazia com toalhas de papel. Massageie suavemente a área abdominal inferior. A gaiola deve ser colocada meio sob uma lâmpada de calor para permitir que o animal entre e saia do gradiente de calor à medida que se recupera. Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
