1. Preparando esferoides tumorais 3D embutidos na ECM
- Prepare uma estação de trabalho com os materiais necessários dentro de uma capela de fluxo laminar.
- Prepare uma mistura diluída de sondas traçadoras fluorescentes de 1 μm de diâmetro modificadas com carboxilato adicionando 2 partes de sondas de estoque (2% de sólidos) a 25 partes de água estéril.
- Retire um frasco de 3,1 mg/ml de colagénio bovino do frigorífico e coloque-o no gelo.
- Alíquota de 125 μl de colagénio para um frasco vazio de 2 ml.
- Adicione 50 μl de solução de sonda traçadora diluída ao frasco para injetáveis que contém o colágeno e o vórtice brevemente para distribuir as sondas.
- Adicionar 235 μl de meios de cultura celular apropriados contendo vermelho de fenol (que ficará amarelo) para um volume total de 410 ml e vórtice brevemente antes de remover 205 ml (metade do volume total) e colocá-lo num novo frasco para injetáveis de 2 ml. O frasco 1 conterá o esferóide tumoral e o frasco 2 será uma mistura de controle.
- Adicione ~ 2 μl de NaOH 1 M ao frasco 1 para trazer a solução de volta ao pH neutro (os meios de cultura contendo vermelho de fenol devem retornar ao vermelho). Observe que isso fará com que a mistura comece a curar se não for mantida no gelo. Vortex brevemente para misturar e, em seguida, retorne à prateleira de gelo imediatamente.
nota: O esferóide é quase invisível a olho nu após 9 dias de cultivo e sua remoção do leito de agarose é uma tarefa delicada. O uso de um microscópio de dissecção pode ser útil para alguns usuários. Manter a integridade do esferóide durante a transferência é fundamental.
- Usando uma ponta de pipeta de boca larga, remova suavemente 40 μl de meio do poço que contém o esferóide tumoral. Retenha esses 40 μl enquanto conduz a próxima etapa.
- Verifique o poço para ver se o esferóide foi removido na etapa anterior. Se estiver, adicione os 40 μl contendo o esferóide ao frasco 1. Caso contrário, coloque os 40 μl de volta no poço e repita a etapa anterior.
- Agite suavemente o frasco 1 (não corra o risco de vórtice, pois pode danificar o esferóide) antes de transferir a mistura em porções de 60 μl para três poços separados de uma placa de 96 poços. Inspecione cada poço com um microscópio após adicionar a mistura para determinar qual poço contém o esferoide.
- Adicione ~ 2 μl 1 M NaOH e 40 μl de meio de cultura celular ao frasco 2 e ao vórtice antes de aliquotar 60 μl dessa mistura para um poço vazio na placa de 96 poços e rotular como controle.
- Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C para curar por pelo menos 1 hora.
2. Construa uma grade de pontos de amostra e faça um vídeo em cada ponto
- Transfira a placa de amostra da incubadora para o estágio de microscópio. Aguarde 10 minutos para que a amostra se equilibre com a temperatura ambiente se um estágio aquecido não estiver disponível.
- Observe a amostra com lentes objetivas de baixa potência para certificar-se de que está intacta e pronta para a imagem. Determine a posição do tumor dentro do poço.
- Decida quantos pontos de amostra tomar. Normalmente, 20 pontos de amostragem em cada poço, distribuídos em anéis concêntricos ao redor do esferoide, produzirão resultados adequadamente detalhados.
- Mova a platina para cada posição desejada e use o software de interface do microscópio para registrar as coordenadas x e y (ou registre as coordenadas manualmente se o software de interface não estiver disponível).
- Mude o microscópio para uma lente objetiva de alta potência (normalmente 100X) e selecione o cubo de filtro apropriado para o comprimento de onda de excitação das sondas traçadoras. Use a lista de pontos criada na etapa 2.4 para mover para o primeiro ponto na grade.
- Ajuste o foco para encontrar o fundo do poço e, em seguida, mova-se para cima para encontrar um campo de visão (fov) contendo várias sondas traçadoras em foco.
- Observe o histograma de intensidade e ajuste a intensidade e o tempo de exposição para obter a maior faixa dinâmica possível, garantindo que a imagem não fique saturada.
- Obtenha uma sequência de vídeo a uma taxa de quadros de 20 a 30 ms por quadro (recomenda-se aproximadamente 800 quadros ou 16 a 24 segundos de duração para fornecer estatísticas suficientes para um cálculo robusto de MSD equilibrado com a necessidade de minimizar o tempo de aquisição em cada ponto da grade espacial) e salve com uma convenção apropriada. Durante a gravação, não toque no microscópio ou na mesa.
- Repita as etapas 2.6 a 2.9 para cada ponto de amostra na grade.
- Repita as etapas 2.3 a 2.10 para cada poço no experimento.
