Avaliação de focos de danos ao DNA: para identificar focos de danos ao DNA induzidos por radiação em linhagens de células cancerígenas usando coloração por imunofluorescência

Resumo

Fonte: Maliszewska-Olejniczak et al. Imagem de imunofluorescência de danos ao DNA e focos de reparo em células de câncer de cólon humano. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo descreve um protocolo para detectar focos de reparo de DNA induzidos por radiação nas linhagens de células de câncer de cólon usando coloração por imunofluorescência. As proteínas de reparo do DNA são ativadas no local do dano ao DNA; portanto, podemos detectá-los usando anticorpos específicos e visualizá-los sob um microscópio de fluorescência.

Protocolo

1. Preparação da cultura celular e montagem experimental

1. Manter células de câncer de cólon humano, HCT-116 conforme recomendado pelo fornecedor, em monocamadas em frascos de^{cultura de 75 cm 2} contendo 10 mL de McCoy's 5a Medium Modified formulado, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de solução antibiótica antibiótica.
2. Cultive células em um ambiente umidificado de 5% de CO₂ a 37 °C até 70% de confluência com renovação média a cada 2 a 3 dias.
3. Para obter o feixe BNCT (por exemplo, feixe de nêutrons mais BPA) e o efeito BNCT de matar células cancerígenas como partículas pes....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lamínulas de 12 mm	VWR	89015-725
Placas de Petri de 35 mm	Sarstedt	7.183.390.000
4-Borono-L-fenilalanina	SIGMA-ALDRICH	Rolamento 17755
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Gibco	15240062
Anticorpo anti-DNA PKcs (fosfo S2056) - Grau ChIP	Abcam	AB18192
Anti-Mouse IgG (molécula inteira) – anticorpo FITC produzido em cabras	SIGMA-ALDRICH	F0257
Antifosfo-histona H2A. X (Ser139) Anticorpo, clone JBW301	MerckMillipore	Nº 05-636
Anticorpo anti-RAD52	Abcam	AB117097
Fração V de albumina sérica bovina (BSA)	Roche	BSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilidol, dicloridrato)	ThermoFisher CIENTÍFICO	D1306
Soro fetal bovino (inativado pelo calor)	SIGMA-ALDRICH	F9665
IgG H&L anti-coelho para cabras (Alexa Fluor 488)	Abcam	AB150077
Linha celular HCT-116	ATCC	CCL-247™
ImagemJ	Instituto Nacional de Saúde (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/
Imagem Pro	Cibernética da mídia	https://www.mediacy.com/imagepro
lâminas de microscópio	ThermoFisher CIENTÍFICO	B-1198
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Instituto Hirszfeld de Imunologia e Terapia Experimental, PAS	20.59.52.0
Tritão X-100	SIGMA-ALDRICH	100 X
Mancha azul de tripano, 0,4%	Logos Biosystems	T13001
Solução de tripsina-EDTA 0,25%	SIGMA-ALDRICH	T4049