1. Semeadura celular
- Semeie 2 x 105 células de câncer colorretal HCT116 por poço em uma placa de 24 poços e mantenha as células no meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) durante a noite a 37 ° C.
- Substituir o meio de cultura por ou sem meio contendo sulfato ferroso (FS) 100 μM ou doxorrubicina 10 μM (DOX) e incubar durante 24 h.
2. Preparação da solução DCFH-DA
- Dissolva 4,85 mg de DCFH-DA em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para fazer uma solução estoque de 10 mM.
- Dilua a solução de estoque com DMEM pré-aquecido em uma solução de trabalho de 10 μM antes de adicioná-la aos poços.
- Vórtice a solução de trabalho por 10 s.
3. Coloração DCFH-DA
- Remova o meio que contém o medicamento e lave uma vez com DMEM.
- Adicione 500 μL da solução de trabalho DCFH-DA em cada poço e incube a 37 °C por 30 min.
- Remova a solução de trabalho DCFH-DA. Lave uma vez com DMEM e 2x com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Adicione 500 μL de 1x PBS a cada poço.
4. Aquisição de imagens e medição de intensidade
- Tire imagens fluorescentes representativas para cada poço usando o canal de proteína fluorescente verde (GFP) em um microscópio de fluorescência.
- Depois de tirar as imagens, remova o PBS e adicione 200 μL de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) a cada poço.
- Incube no gelo por 5 min e, em seguida, colete o lisado celular em tubos de 1,5 mL.
- Centrifugar a 21.130 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transferir 100 μL do sobrenadante para uma placa preta de 96 poços e medir a intensidade de fluorescência utilizando um leitor de microplacas de fluorescência a um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm.
- Transfira 1 μL do sobrenadante para uma placa transparente de 96 poços contendo 100 μL de solução de ensaio de proteína 1x para medir a concentração de proteína usando o ensaio de Bradford.
- Normalize as intensidades de fluorescência com concentrações de proteínas.
