Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Cultura de linhagens celulares
- Cultive células HK em meio RPMI-1640 completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 nM de glutamina, 100 U/mL de penicilina G e 100 mg/mL de estreptomicina a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
nota: As células HK são células dendríticas foliculares humanas normais e podem ser cultivadas e expandidas por ≤ 15 passagens in vitro.
2. Marcação e enriquecimento de tumores marcados com luciferase
- Implante tumores diretamente no flanco esquerdo e direito de camundongos NOD/SCID fêmeas de 6 a 8 semanas de idade.
- Meça o crescimento do tumor quinzenalmente usando um paquímetro digital.
- Com 1 cm de diâmetro, transduzir o tumor. Injete diretamente no tumor uma dose única de Luc/proteína fluorescente vermelha (RFP)-lentivírus (50 μL/tumor, diluição 1:30 do estoque concentrado de lentivírus de alto título) usando uma seringa de 1 cc com uma agulha de 27 G.
nota: O tumor do paciente geralmente atinge 1 cm de diâmetro em 1-2 meses. No entanto, a taxa de crescimento é extremamente variável e baseada em vários fatores, incluindo o grau e o tipo do tumor.
3. Modelo de mouse CRC
- Anestesiar um camundongo NOD/SCID macho de seis a oito semanas de idade com isoflurano (2,5% em oxigênio a 100%, 1 L/min) na câmara de indução. Confirme a sedação com um beliscão no dedo do pé.
- Coloque o camundongo anestesiado em decúbito dorsal sob um microscópio de dissecação, certificando-se de prender seu focinho a um cone nasal de isoflurano e seus membros anteriores com fita adesiva para estabilidade.
nota: Lupas podem ser usadas em vez de um microscópio de dissecação. Um pequeno objeto pode ser usado para melhorar a visibilidade e o ângulo quando colocado sob a base da cauda, elevando o ânus. Normalmente, pequenas seções de gaze são enroladas em forma de cilindro de 1 polegada de diâmetro.
- Dilate o canal anal com pinças curvas lubrificadas de ponta romba para expor a mucosa anal e retal distal. Remova as fezes.
- Use uma agulha removível estéril de 30 G em uma seringa de vidro de 50 μL para injetar 10 μL de células tumorais marcadas com luciferase e células HK (ressuspenda 10 μL de células tumorais por camundongo para o modelo CRC em meio RPMI completo) na submucosa retal posterior distal, 1 a 2 mm acima do canal anal. O bisel da agulha deve ser coberto por mucosa. Tenha cuidado para não passar para a cavidade pélvica.
- Remova o mouse do cone nasal de isoflurano. Observe-o por 1 h após o procedimento. Procure sinais de angústia, ou seja, costas curvadas, respiração difícil, etc.
4. Imagem bioluminescente
- Monitore a carga metastática primária do tumor, fígado e pulmão semanalmente usando um sistema de imagem bioluminescente para atividade de luciferase.
- Obtenha um experimento CRC em camundongos e pese. Injete 150 mg / kg de luciferina por via intraperitoneal e aguarde 5 minutos para que o substrato circule no corpo do camundongo.
- Anestesiar o camundongo com isoflurano a 2,5% em oxigênio a 100%, 1 L/min na câmara de indução.
- Coloque o mouse em uma máquina de imagem BLI com o nariz fixado no cone do nariz. Ao expor para imagem, certifique-se de que a área de interesse esteja voltada para a câmera. Para injeção de CRC, o lado ventral deve estar voltado para a câmera para cada imagem. Imagem do mouse em decúbito dorsal.
