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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. A preparação do huA33-TCO
NOTA: A síntese de huA33-TCO foi relatada anteriormente. No entanto, para facilitar o leitor, ele é replicado aqui com ajustes para condições ideais.
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare uma solução de 125 μL de carbonato de (E)-cicloocto-4-enilo 2,5-dioxo-1-pirrolidinilo (TCO-NHS) em dimetilformamida seca (DMF) a uma concentração de 40 mg/mL (0,15 M). Esta solução pode ser aliquotada e congelada a -80 °C para utilização em experiências futuras.
- Em um tubo de microcentrífuga separado de 1,7 mL, prepare uma solução de 5 mg / mL de huA33 em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; cloreto de potássio 2,7 mM, cloreto de sódio 137 mM e fosfato de potássio 11,9 mM, pH 7,4).
- Usando pequenas alíquotas (<5 μL) de 0,1 M Na2CO3, ajuste o pH da solução de anticorpos da Etapa 1.2 para 8,8-9,0. Use papel de pH ou um medidor de pH com um microeletrodo para monitorar o pH e tome cuidado para que o pH não exceda 9,0.
- À solução de anticorpos descrita na Etapa 1.3, adicione lentamente um volume correspondente a 40 equivalentes molares de TCO-NHS em relação à quantidade de anticorpos. Por exemplo, se 5 mg (30 nmol) de huA33 estiverem na solução, adicione 9,0 μL (1,20 μmol) da solução de 40 mg/mL (0,15 M) de TCO-NHS.
nota: O TCO-NHS é hidrofóbico. Ao adicioná-lo à solução de anticorpos, adicione-o lentamente e com agitação para evitar precipitação. Não exceda 10% de DMF em volume na solução de reação final.
- Deixar incubar a reacção a 25 °C num termomisturador durante 1 h com agitação ligeira (500 rpm).
- Após 1 h, purificar o imunoconjugado huA33-TCO usando uma coluna de dessalinização descartável pré-embalada.
- Equilibre a coluna de exclusão de tamanho conforme descrito pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento. Um procedimento típico envolve a lavagem da coluna 5x com um volume de PBS que corresponde ao volume da coluna: 5 x 2,5 mL de PBS.
- Adicione a mistura de reação à coluna de exclusão de tamanho, observando o volume da mistura de reação.
- Depois que a mistura de reação entrar na coluna, adicione uma quantidade apropriada de PBS para elevar o volume total da solução adicionada à coluna para 2,5 mL. Por exemplo, se a reação de conjugação resultou em um volume total de 1,3 mL, adicione 1,2 mL de PBS adicional à coluna.
- Colete o produto usando 2 mL de PBS como eluente.
nota: Esta etapa produzirá a construção final huA33-TCO em 2 mL de PBS, pH 7,4.
- Medir a concentração do huA33-TCO utilizando um espectrofotómetro UV-Vis que monitoriza o comprimento de onda de 280 nm. O coeficiente de extinção molar para a maioria dos IgGs (ε280) é 210.000 M-1 cm-1.
- Se desejar uma solução com uma concentração mais alta de imunoconjugado, concentre a solução huA33-TCO usando uma unidade de filtro centrífugo com um corte de 50.000 pesos moleculares, seguindo as instruções do fabricante.
nota: Sabe-se que muitos anticorpos se agregam ou precipitam durante a concentração. Ao tentar este procedimento com um novo anticorpo, os pesquisadores devem se referir à literatura ou à sua própria experiência no manuseio do anticorpo em questão.
- Conservar imediatamente o imunoconjugado huA33-TCO completo a 4 °C na obscuridade, se necessário. Se for usado mais de 4 dias no futuro, armazene-o a -80 °C no escuro.
nota: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O imunoconjugado huA33-TCO completo deve ser estável por pelo menos 6 meses de armazenamento a -80 °C no escuro.
2. A síntese de Tz-PEG 7-NHBoc
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, dissolva 5 mg de éster N-hidroxisuccinimidílico de tetrazina (Tz-NHS; 12,6 μmol) em 0,15 mL de dimetilsulfóxido anidro (DMSO).
- Em um tubo de microcentrífuga separado de 1,7 mL, dissolva 8 mg do polímero amino PEG protegido por Boc, O-(2-aminoetil)-O'-[2-(Boc-amino)etil]hexaetilenoglicol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) em 0,15 mL de DMSO anidro.
- À solução de Tz-NHS, adicione 3 μL (21,3 μmol, 1,7 equivalentes molares) de trietilamina (TEA) e misture bem.
- Adicione a solução de tetrazina rosa à solução NHBoc-PEG7-NH 2 da Etapa 2.2 e incube a mistura de reação por 30 min em temperatura ambiente (RT) com agitação leve.
- Após 30 minutos, diluir a mistura de reacção 1:1 em H2O e purificá-la com cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase invertida C18 para separar qualquer Tz-NHS não reagido do Tz-PEG 7-NHBoc. Use solventes sem ácido para evitar a remoção prematura do grupo protetor Boc. Monitore o Tz-PEG 7-NHBoc e o Tz-NHS em um comprimento de onda de 525 nm.
nota: Os tempos de retenção dependem muito do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc.), devendo ser efectuados controlos adequados antes da purificação. No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos sem qualquer aditivo) a 95:5 MeCN/H2O em 30 min, uma taxa de fluxo de 1 mL/min e uma coluna analítica de 4,6 mm x 250 mm C18 são usadas, os tempos de retenção de Tz-NHS e Tz-PEG 7-NHBoc são de cerca de 16 min e 18 min, respectivamente.
- Congelar o eluente HPLC recolhido com azoto líquido e embrulhar o tubo de recolha agora congelado em folha de alumínio. Coloque o tubo de coleta congelado em um liofilizador durante a noite para remover a fase móvel da HPLC. O produto será um sólido rosa brilhante característico.
nota: Se o azoto líquido não estiver disponível, congelar o eluente HPLC recolhido em gelo seco ou durante a noite num congelador a -80 °C.
3. A Síntese de Tz-PEG7-NH 2
- Ao produto da Etapa 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc, adicione 1,5 mL de diclorometano (DCM) e transfira esta solução para um pequeno balão de fundo redondo.
- Adicione 0,25 mL de ácido trifluoroacético (TFA) gota a gota à solução rosa da Etapa 3.1.
- Deixe a reação incubar por 30 min em RT com agitação leve.
- Após 30 min, evaporar o solvente por evaporação rotativa. Não exceda a temperatura do banho-maria de 37 °C.
- Reconstitua o produto viscoso rosa em 0,5 mL de água.
- Purificar o produto utilizando HPLC C18 de fase inversa para separar o Tz-PEG7-NH 2 do precursor protegido contra o Boc. Monitore o Tz-PEG 7-NHBoc e o Tz-PEG7-NH 2 em um comprimento de onda de 525 nm.
nota: Os tempos de retenção dependem muito do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc.), devendo ser efectuados controlos adequados antes da purificação. No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos com 0,1% de TFA) a 95:5 MeCN/H2O em 30 min, uma taxa de fluxo de 1 mL/min e uma coluna analítica de 4,6 mm x 250 mm C18 forem usadas, os tempos de retenção de Tz-PEG 7-NHBoc e Tz-PEG7-NH 2 são de cerca de 18 min e 13 min, respectivamente.
- Congelar o eluente HPLC recolhido com azoto líquido e envolver o tubo de recolha agora congelado em folha de alumínio. Coloque o tubo de coleta congelado em um liofilizador durante a noite para remover a fase móvel da HPLC. O produto será um sólido rosa brilhante.
- Reconstitua o produto da Etapa 3.7, Tz-PEG7-NH 2, com 150 μL de DMSO e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Medir a concentração de Tz-PEG7-NH 2 utilizando um espectrofotómetro UV-Vis que monitoriza o comprimento de onda de 525 nm. O coeficiente de extinção molar para Tz-PEG7-NH 2 (ε525) é 535 M-1 cm-1
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4. A Síntese de Tz-PEG7-DOTA
- Dissolva o Tz-PEG7-NH 2 (4,5 mg, 6,9 μmol) em 0,15 mL de DMSO (ou prossiga com a solução criada na Etapa 3.8).
- Adicione 22 equivalentes molares de TEA (21 μL, 0,15 mmol) à solução contendo tetrazina da Etapa 4.1.
- Adicione 10 mg (14,2 μmol) de p-SCN-Bn-DOTA como sólido e vortex a solução por cerca de 2 min ou até que o material esteja totalmente dissolvido.
- Deixe a reação incubar por 30 min em RT com agitação leve.
- Após 30 minutos, diluir a reação 1:1 em H2O e purificar o produto usando HPLC C18 de fase reversa para remover o p-SCN-Bn-DOTA não reagido. O p-SCN-Bn-DOTA pode ser monitorado em um comprimento de onda de 254 nm, enquanto o Tz-PEG7-DOTA é melhor monitorado em um comprimento de onda de 525 nm.
nota: Os tempos de retenção são obviamente altamente dependentes do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc.), e os controles apropriados devem ser executados antes da purificação. No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos com 0,1% de TFA) a 95:5 MeCN/H2O em 30 min e uma coluna analítica de 4,6 x 250 mm C18 forem usadas, Tz-PEG7-DOTA e p-SCN-Bn-DOTA têm tempos de retenção de cerca de 15,6 min e 16,1 min, respectivamente.
- Congelar o eluente HPLC recolhido com azoto líquido e embrulhar o tubo de recolha agora congelado em folha de alumínio. Coloque o tubo de coleta congelado em um liofilizador durante a noite para remover a fase móvel da HPLC. O produto será um pó rosa brilhante.
- Reconstituir o produto em 0,15 ml de DMSO e medir a concentração utilizando um espectrofotómetro UV-Vis que monitoriza o comprimento de onda de 525 nm. O coeficiente de extinção molar para Tz-PEG7-DOTA (ε525) é 535 M-1 cm-1.
- Analise o composto final por ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) para verificar se a síntese foi bem-sucedida. Veja a Tabela 1 para os deslocamentos químicos e pesos moleculares determinados experimentalmente de todos os compostos discutidos neste trabalho.
- Armazene a solução purificada de Tz-PEG7-DOTA no escuro a -80 °C.
nota: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O precursor Tz-PEG7-DOTA completo é estável por pelo menos 1 ano nessas condições.
5. 177Lu Radiorotulagem de Tz-PEG7-DOTA
CUIDADO: Esta etapa do protocolo envolve o manuseio e manipulação da radioatividade. Antes de realizar essas etapas - ou realizar qualquer outro trabalho com radioatividade - os pesquisadores devem consultar o Departamento de Segurança de Radiação de sua instituição de origem. Tome todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.
NOTA: Ao trabalhar com pequenas quantidades de radiometais, recomenda-se que todos os tampões estejam livres de traços de metais para evitar interferência na ligação do local de coordenação.
- Em um tubo de centrífuga de 1,7 mL, adicione 200 μL de tampão acetato de amônio 0,25 M ajustado com alíquotas de HCl 1 M a pH 5,5.
nota: Se estiver usando menos de 370 MBq de atividade para a rotulagem, o volume de tampão usado deve ser reduzido para 100 μL.
- Adicione a quantidade desejada de [177Lu]LuCl3 à solução tampão. A quantidade adicionada dependerá do número de sujeitos no experimento e das doses radioativas administradas. Recomenda-se que 1-2 doses extras de radioatividade sejam adicionadas como precaução para compensar a perda potencial de radioatividade durante as etapas de purificação.
- Adicione Tz-PEG7-DOTA em DMSO à mistura radioativa na Etapa 5.2. A quantidade de Tz-PEG7-DOTA depende do número de indivíduos que estão sendo testados. Mais detalhes sobre este tópico podem ser encontrados na Etapa 6.2.2.2.
- Deixar incubar a solução a 37 °C durante 20 min.
- Verifique se a radiomarcação está completa usando cromatografia instantânea de camada fina de rádio (radio-iTLC) com 50 mM EDTA, pH 5,5 como fase móvel. O [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz rotulado permanecerá na linha de base — Rf = 0 — enquanto o [177Lu]Lu3+ livre será coordenado pelo EDTA e viajará com a frente do solvente, Rf = 1,0 (Figura 1B).
- Se a marcação quantitativa não for alcançada, adicione ligantes para coordenar o radiometal livre. Como alternativa, purifique o [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz rotulado usando um cartucho C18. Siga as instruções de uso do fabricante. Um exemplo de procedimento é dado abaixo.
- Prepare o cartucho passando lentamente 5 mL de etanol pelo cartucho com uma seringa grande. Em seguida, passe por 5 mL de acetonitrila e depois 5 mL de H2O deionizado (DI).
- Retirar a solução radioligante do Passo 5.3 numa seringa mais pequena e injetá-la lentamente no cartucho C18. Em seguida, lave o cartucho com 10 mL de DI H2O para remover qualquer [177Lu]LuCl3 não ligado.
- Eluir com 500 μL de etanol. Remova qualquer etanol do produto final passando sobre o recipiente com uma baixa vazão de nitrogênio seco ou argônio por 10-15 min. Em seguida, ressuspenda o radioligante em solução salina em um volume determinado na Etapa 6.2.2.2.
6. Estudos in vivo
CUIDADO: Como na Seção 5, esta etapa do protocolo envolve o manuseio e manipulação da radioatividade. Antes de realizar essas etapas, os pesquisadores devem consultar o Departamento de Segurança de Radiação de sua instituição de origem. Tome todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.
- Preparação de animais
- Em camundongos fêmeas nus atímicos, implante subcutaneamente 5 x 106 SW1222 células de câncer colorretal suspensas em 150 μL de uma mistura 1:1 de meio celular e matriz (por exemplo, Matrigel) e permita que elas cresçam em um xenoenxerto3 de 100-150 mm (14-18 dias após a inoculação).
- Triagem de animais para um experimento de biodistribuição
- Uma vez que os tumores tenham tamanho suficiente, conforme determinado pela medição do paquímetro, classifique os animais para garantir que cada coorte tenha aproximadamente o mesmo volume médio de tumor. Os animais podem ser distinguidos em cada gaiola por marcações na cauda com tinta indelével (uma faixa, duas faixas, etc.).
- Triagem de animais para um estudo de terapia longitudinal
- Uma vez que os tumores tenham tamanho suficiente, conforme determinado pela medição do paquímetro, prenda brincos em cada um dos animais para garantir o rastreamento correto durante todo o experimento.
nota: Marcas auriculares numéricas podem cair ao longo do experimento. Como resultado, recomenda-se acompanhar essas etiquetas físicas com entalhes nas orelhas de maneira sistemática (ou seja, direita, esquerda, bilateral, direita x 2, esquerda x 2).
- Classifique os animais de forma que o volume médio do tumor em cada coorte seja aproximadamente igual. O seguinte método de classificação de animais pode ser realizado usando um programa de planilha.
- Liste os números de identificação do animal, o padrão de entalhe da orelha e o volume do tumor em três colunas separadas.
- Classifique os dados do menor para o maior volume de tumor.
- Em uma quarta coluna, atribua a cada animal um número de gaiola e percorra as gaiolas em um padrão semelhante a uma cobra. Por exemplo, se houver 5 gaiolas, esta coluna seria preenchida "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." até que todos os animais recebam uma gaiola.
- Depois que as gaiolas forem atribuídas, classifique os dados pelo número da gaiola. Se entalhes de orelha estiverem sendo usados, certifique-se de que cada animal em uma determinada gaiola tenha um padrão de entalhe de orelha exclusivo. Se duplicar (dois ou mais do mesmo padrão) em uma determinada gaiola, troque um mouse por um de outra gaiola com o padrão ausente até que cada gaiola tenha animais com padrões de entalhe de orelha exclusivos.
- Formulações e Injeções
nota: A sequência de injeção para estudo de biodistribuição e terapia prossegue da seguinte forma: huA33-TCO é injetado primeiro, seguido por [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz após um intervalo pré-determinado.
- Imunoconjugado
- Diluir uma alíquota da solução huA33-TCO do Passo 1.9 até uma concentração de 0,8 mg/ml em solução salina estéril a 0,9%.
- Extrair doses de 150 μL (100 μg) de solução de huA33-TCO em seringas pré-tratadas com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em PBS e armazenar essas seringas em gelo.
nota: O tratamento com BSA reduz a ligação não específica do anticorpo às paredes da seringa.
- Aqueça o animal sob uma lâmpada de calor por 3 minutos para dilatar a veia da cauda.
- Injete a solução huA33-TCO na veia da cauda do camundongo portador de xenoenxerto. Aguarde 24 h (ou um intervalo de tempo pré-determinado diferente) para que o huA33-TCO se acumule no tumor do camundongo.
- Radioligante
- Radiolabel Tz-PEG7-DOTA conforme descrito na Seção 5.
- Retire doses em 150 μL de solução salina estéril a 0,9% contendo 1,1 equivalente molar de Tz-PEG7-DOTA em relação à quantidade de huA33-TCO administrada. Por exemplo, se 100 μg (0,67 nmol) de huA33-TCO foram injetados no animal e a mistura de reação [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz foi feita com uma atividade específica de 12,4 GBq/μmol, então serão retiradas doses contendo 9,14 MBq de atividade cada. Isso corresponde a 0,74 nmol de Tz (1,1 molar eq. em relação a huA33-TCO).
- Aqueça os animais sob uma lâmpada de calor por 3 min para dilatar a veia da cauda.
- Injete a dose de radioligante na veia da cauda do camundongo portador de xenoenxerto. A quantidade de atividade a ser injetada é determinada pelo pesquisador. Os dados publicados mostraram efeitos terapêuticos dependentes da dose no tamanho do tumor dentro de uma faixa de 7,4 a 55,5 MBq.
