Extração de miRNA circulante: um método para isolar miRNA de amostras de plasma por meio de extração orgânica e enriquecimento de RNA pequeno

Abstract

Fonte: Canale, M. et al., Detecção de um painel personalizado de microRNA circulante em pacientes com câncer colorretal metastático. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a extração de microRNA circulante de amostras de plasma de pacientes com câncer colorretal usando extração orgânica seguida de enriquecimento em coluna de fibra de vidro. Os miRNAs são estáveis em fluidos biológicos, como soro e plasma, o que os torna biomarcadores circulantes ideais para diagnóstico de câncer, prognóstico e tomada de decisão e monitoramento de tratamento. Este método ajudará a identificar novos biomarcadores circulantes capazes de prever resultados clínicos em pacientes.

Protocol

NOTA: Execute todas as etapas a seguir sob uma capela esterilizada de acordo com as Boas Práticas de Laboratório (BPL).

1. Coleta e armazenamento de plasma

1. Colete 3 mL de amostra de sangue periférico em um tubo K3E EDTA.
2. Centrifugue o tubo à temperatura ambiente a 1.880 x g por 15 min.
3. Recuperar o plasma sobrenadante em alíquotas de 450 μL.
4. Armazenar as amostras a -80 °C até o uso.
   NOTA: Processe o tubo de sangue periférico dentro de 2 h após a coleta. Ao recuperar o plasma do tubo, não perturbe a camada linfocitária.

2. Extração de miRNAs circulantes de amostras de plasma

1. Preparar todas as soluções necessárias e descongelar as amostras para as etapas de extração.
   1. Adicione 375 μL de 2-mercaptoetanol à solução desnaturante 2x e misture bem.
   2. Adicione 21 mL de etanol 100% grau ACS à solução de lavagem de miRNA I e misture bem.
   3. Adicione 40 mL de etanol 100% grau ACS à solução de lavagem 2/3 e misture bem.
   4. Deixar uma alíquota de plasma descongelar à temperatura ambiente e, em seguida, iniciar os passos de extracção.

2. Extração orgânica
   1. Transfira 400 μL da amostra de plasma para um tubo de 2 mL sem RNase.
   2. Adicionar 400 μL de solução desnaturante 2x, misturar por vórtice e centrifugar brevemente.
   3. Adicione 4 μL de pico de 1 nM, misture por vórtice e centrifugue brevemente.
   4. Adicione 800 μL de fenol-clorofórmio ácido.
   5. Vortex por 60 s e centrifugue na velocidade máxima (≥10.000 x g) por 15 minutos.
   6. Transferir a fase aquosa superior para um tubo novo. Não perturbe a interfase. Anotar o volume recuperado e descartar o tubo contendo a fase não aquosa.
      nota: A solução desnaturante 2x é armazenada a 4 °C e pode solidificar a esta temperatura. Antes de usar, aqueça a solução a 37 °C, agitando ocasionalmente por 10-15 min. Tenha o cuidado de retirar a fase inferior que contém o ácido fenol-clorofórmio, e não o tampão aquoso que se encontra no topo da mistura. Pré-aqueça a solução de eluição ou água isenta de nuclease a 95 °C. Tenha o cuidado de aquecer um volume adequado de solução (100 μL por amostra + 10% de excesso).

3. Pequeno enriquecimento de RNA
   1. Adicione 1/3 do volume de etanol 100% à fase aquosa da etapa 2.2.6 e misture bem.
   2. Coloque um cartucho de filtro em um novo tubo de coleta para cada amostra.
   3. Transfira até 700 μL de lisado da etapa 2.3.1 e etanol para o cartucho do filtro e centrifugue a 10.000 x g por 30 s.
   4. Se restarem >700 μl de mistura, colocar o filtrado num tubo novo e repetir o passo 2.3.3; repetir até que toda a mistura tenha passado através do cartucho filtrante.
   5. Meça o volume total do fluxo.
   6. Adicione 2/3 do volume de etanol 100% ao filtrado e misture bem.
   7. Coloque um segundo cartucho de filtro em um novo tubo de coleta.
   8. Transfira até 700 μL de volume de amostra para o cartucho e centrifugue a 10.000 x g por 30 s. Descarte o fluxo.
   9. Repita a etapa 1.3.8 até que toda a mistura tenha passado pelo cartucho do filtro.
   10. Aplique 700 μL de solução de lavagem de miRNA 1 no cartucho do filtro e centrifugue o cartucho do filtro com o tubo de coleta a 10.000 x g por 15 s. Descarte o fluxo. Coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta.
   11. Aplique 500 μL de solução de lavagem 2/3 no cartucho do filtro e centrifugue o cartucho do filtro com o tubo de coleta a 10.000 x g por 15 s. Descarte o fluxo. Coloque o cartucho do filtro em um tubo de coleta novo.
   12. Coloque o cartucho do filtro em um tubo de coleta novo e repita a etapa 2.3.11 com 500 μL de solução de lavagem 2/3. Descarte o fluxo e transfira o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta.
   13. Centrifugue os tubos com os cartuchos do filtro a 10.000 x g por 1 min.
   14. Transfira o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta de 1,5 mL e adicione 100 μL de solução de eluição pré-aquecida (95 °C) ou água sem nuclease.
   15. Centrifugar a 10.000 x g por 30 s para recuperar miRNAs e armazenar a -80 °C.
       nota: Um precipitado branco pode se formar na solução de lavagem 2/3. Este precipitado é o excesso de EDTA liberado da solução. Evite aspirar esses cristais durante as etapas de pipetagem.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de 1,5 mL com trava segura sem rnase	Eppendorf	0030 123.328
Ponteiras de 1000 μL sem Rnase	Laboratório estelar	S1122-1830
Tubos de 2 mL com trava segura sem rnase	Eppendorf	Nº 0030 123.344
Ponteiras de 20 μL sem Rnase	Laboratório estelar	S1123-1810
Ponteiras de 200 μL sem Rnase	Laboratório estelar	S1120-8810
Kit de Purificação de RNA e Proteína Nativa mirVana PARIS	Thermo Fisher	AM1556
100% etanol anidroso grau ACS	Reagentes Carlo Erba	414605
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Pipetas de laboratório de 0,2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 μL
Hotte
Microcentrífuga de bancada
vórtice