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Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Isolamento de DNA genômico de fezes
NOTA: Utilize um kit comercial para isolar o DNA microbiano das fezes seguindo um protocolo de detecção de patógenos nas fezes. Retirar as amostras directamente do congelador a -80 °C e conservá-las em gelo seco durante a pesagem.
- Transfira até 220 mg de fezes para um tubo de microcentrífuga limpo contendo 1,4 mL de tampão de lise de fezes em temperatura ambiente (RT) (consulte a Tabela de Materiais).
- Amostra de vórtice por 1 min para homogeneizar completamente os sólidos (Figura 1B). Aquecer a suspensão a 95 °C durante 5 min para lisar todas as bactérias (incluindo bactérias Gram-positivas).
- Amostras de vórtice por 15 s e depois centrifugue a 20.000 x g por 1 min para pellet os sólidos das fezes. Transfira o sobrenadante para um tubo de microfuga de 2 mL. Adicione um comprimido a cada amostra para absorver os inibidores de PCR, vórtice até que o comprimido seja dissolvido e incube a amostra em RT por 1 min.
- Centrifugue a amostra a 20.000 x g por 3 min e transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 20.000 x g por 3 min. Alíquota de 15 μL de proteinase K (estoque de 20 mg/mL) em um novo tubo de microfífuga de 1,5 mL. Pipetar 200 μL da amostra para o tubo contendo a proteinase K.
- Adicione 200 μL de tampão de lise de cloreto de guanidínio ao tubo, vortex completamente por 15 s (ver Tabela de Materiais) e incube a amostra a 70 ° C por 10 min. Adicione 200 μL de etanol (96-100%) aos tubos e misture bem por vórtice.
- Coloque uma coluna de centrifugação à base de sílica em um tubo de coleta de 2 mL e aplique as amostras na coluna. Feche a tampa e centrifugue por 1 min a 20.000 x g.
- Transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 2 mL e adicione 500 μL de tampão de lavagem 1 à coluna, tampe a coluna e centrifugue por 1 min a 20.000 x g. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 2 mL e adicione 500 μL de tampão de lavagem 2 à coluna, Feche a tampa e centrifugue a 20.000 x g por 3 min.
- Com a tampa fechada, transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 2 mL e centrifugue por mais 1 min a 20.000 x g para remover o tampão de lavagem residual. Transfira a coluna para um tubo de microfuga marcado com 1,5 mL e elua a amostra adicionando 200 μL de tampão de eluição contendo EDTA à membrana (consulte a Tabela de Materiais).
- Feche a tampa e incube em RT por 1 min. Centrifugue a amostra por 1 min a 20.000 x g. Descarte a coluna.
2. Determinação da concentração de DNA e preparação de amostras para PCR
NOTA: Utilize um fluorômetro e um ensaio fluorescente de dsDNA disponível comercialmente para determinar a concentração de DNA genômico em cada amostra (consulte a Tabela de Materiais). O corante fluorescente deve se ligar especificamente ao DNA de fita dupla.
- Preparar uma diluição de 1:200 de cada amostra (1 μL de cada amostra em 199 μL de master mix de dsDNA) e uma diluição de 1:50 dos padrões. Analise em um fluorômetro usando a configuração dsDNA.
Nota: Um alto volume de DNA na PCR pode ser inibitório, portanto, o volume de DNA utilizado não deve ser superior a 10% do volume final da PCR. Um fluorômetro permite a medição precisa do DNA na amostra, pois apenas o DNA ligado ao corante fluorescente irá fluorescer, eliminando a possível contribuição de contaminantes para a concentração final de DNA calculada. Esse nível de quantificação precisa é essencial para a aplicação de sequenciamento downstream.
- Prepare modelos de PCR diluídos a 5 ng/μL com o volume apropriado de 10 mM Tris, pH 8,5 para fazer estoques de modelos de trabalho de cada amostra.
- Armazene as amostras a -20 °C.
3. Projete primers para as regiões V desejadas 16S
- Projete primers para amplificar seletivamente as regiões V 16S rRNA desejadas.
- Analise primers com Probe Match, do Ribosomal Database Project, para determinar a taxa de acerto aproximada para vários filos.
Nota: Para as regiões V1-V3, o estudo atual usou os primers publicados Bosshard forward, que se ligam na posição 8 dentro da região V1, e 533 reverse, que se liga na posição 533 dentro da região V3. Os primers devem incluir sequências de adaptadores de saliência para indexação.
- Ao projetar primers, inclua sequências adaptadoras nas extremidades 5' de cada primer, conforme recomendado para a preparação da biblioteca de sequenciamento metagenômico 16S (Tabela 1).
- Sintetize esses primers grandes com purificação de cartucho. Reconstituir primers dessecados e diluir um material de trabalho de PCR a 1 μM em Tris 10 mM, pH 8,5.
4. Amplicon PCR para amplificar a(s) região(ões) V com sequências de adaptadores de saliência anexadas
- Configure a mistura de reação de PCR amplicon conforme descrito na Tabela 2.
- Coloque uma vedação adesiva transparente da placa PCR na placa e execute a PCR do amplicon usando os parâmetros da Tabela 3.
- (Opcional) Execute produtos de PCR de amplicon em um gel de agarose ou um ensaio de DNA de alta sensibilidade que permita a medição quantitativa do tamanho do amplicon (consulte a Tabela de Materiais).
Nota: O tamanho do amplicon deste estudo é de 550 bp (Figura 2a).
5. Limpeza de PCR usando esferas magnéticas
- Centrifugue a placa de PCR do amplicon rapidamente a 1.000 x g por 1 min para coletar a condensação.
nota: As tiras de tubo PCR podem ser usadas em vez de placas PCR para minimizar a contaminação. Descarte as tampas dos tubos e nunca as reutilize.
- Vortex os grânulos magnéticos para dispersá-los uniformemente e adicione 20 μL de grânulos magnéticos a cada poço de PCR do amplicon e, em seguida, pipete todo o volume para cima e para baixo lentamente 10 vezes.
- Incubar em RT por 5 min. Coloque a placa de PCR em um suporte magnético por 2 min até que as esferas magnéticas sejam coletadas e o sobrenadante esteja claro. Remova e descarte o sobrenadante.
- Lave os grânulos com 200 μL de etanol fresco a 80% enquanto a placa de PCR está no suporte magnético e incube por 30 s em RT no suporte magnético. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
- Repita a lavagem pela segunda vez. Agora, use uma ponta de pipeta fina para remover qualquer etanol residual dos poços e deixe secar ao ar por 10 min.
- Remova a placa PCR do suporte magnético e adicione 52,5 μL de 10 mM Tris pH 8,5 a cada poço. Pipete para cima e para baixo 10 vezes para suspender os grânulos e incubar em temperatura ambiente por 2 min.
- Transfira a placa PCR para o suporte magnético para coletar esferas magnéticas e transfira 50 μL do sobrenadante para uma placa PCR limpa. Coloque um selo de placa PCR transparente na placa e armazene a -20 °C por até uma semana.
| Amplicon PCR Primers |
| encaminhar | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| inverter | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| As sequências específicas do local de locus são mostradas em negrito e a não negrito é a sequência do adaptador de saliência. |
Tabela 1: Primers de PCR de amplicon.
| Configuração da reação de PCR do amplicon | |
| volume |
| DNA microbiano (5ng/μl) | 2,5 μl |
| Primer direto (1 μM; da etapa 3.1) | 5,0 μl |
| Primer reverso (1 μM; da etapa 3.1) | 5,0 μl |
| 2X Mistura pronta para HotStart | 12,5 μl |
| total | 25,0 μl |
Tabela 2: Primers de PCR Amplicon.
| Configuração de PCR Amplicon |
| 95 °C durante 3 minutos | |
| 25 ciclos de: | |
| 95 °C durante 30 segundos |
| 55 °C durante 30 segundos |
| 72 °C durante 60 segundos |
| 72 °C durante 3 minutos | |
| Manter a 4 °C | |
Tabela 3: Configuração do programa de PCR Amplicon.
