Marcação de células organoides CRC: um método para gerar células organoides de câncer colorretal transduzidas por lentivírus GFP

Resumo

Fonte: Okazawa Y. et al., Detecção de alta sensibilidade de micrometástases geradas por organoides transduzidos por lentivírus GFP cultivados a partir de um tumor de cólon derivado de paciente. (2018).

Este vídeo descreve a técnica de geração de organoides CRC transduzidos por partículas lentivirais GFP para permitir imagens fluorescentes. Esses organoides marcados com GFP, quando colocados em modelos animais, ajudam a estudar a invasão tumoral e a metástase.

Protocolo

1. Geração de Organoides CRC Cultivados em Matriz Extracelular Artificial

Os procedimentos experimentais para a cultura do organoide CRC dos PDXs do cólon são descritos na Figura 1B (etapa 4).

1. Estabelecer um meio de cultura adequado para os organoides CRC derivados de PDX (ver Tabela de Materiais, "o meio de cultura organoide CRC") empregando meios previamente descritos para organoides de cólon humano.
2. Aplique 150 μL de matriz extracelular artificial (consulte a Tabela de Materiais) por poço em uma placa de 12 poços no gelo e, em seguida, incube-o por 30-60 min em uma incubadora de CO₂ a 37 ° C e 5% para solidificar os géis.
3. Suspenda o pellet celular de células CRC obtidas do modelo de camundongo PDX com o meio de cultura organoide CRC (da etapa 1.1) com 5% FCS para ajustar a 3 x 10⁵ células/mL. Em seguida, semeie 1 mL do meio na placa revestida com matriz extracelular artificial preparada na etapa 1.2 e incube durante a noite a 37 ° C sob 5% de CO₂. Use um hemocitômetro para contar o número de células tumorais, incluindo células únicas e aglomerados multicelulares (um grupo de células aderentes) na suspensão celular.
   NOTA: 5% FCS é usado para extinguir a atividade enzimática residual da colagenase neste estudo.
4. Colete cuidadosamente o meio de cultura, incluindo células flutuantes separadas da placa revestida com matriz extracelular artificial, em um tubo de centrífuga de 1,5 mL no dia seguinte e centrifugue-o a 1.400 x g por 5 min. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 70 μL de matriz extracelular artificial no gelo.
5. Para aumentar a viabilidade das células CRC, sobreponha a matriz extracelular artificial contendo células tumorais nas células organoides tumorais ligadas à placa revestida com matriz extracelular artificial e incube por 30 min em uma incubadora de CO₂ a 37 ° C, 5% solidifique o revestimento da matriz extracelular artificial. Em seguida, incube-o com 1 mL do meio de cultura de células organoides CRC com 1% de FCS a 37 °C sob 5% de CO₂.
6. Mude o meio de cultura a cada dois dias. À medida que os organoides CRC preenchem o meio, pode ser necessário trocar o meio diariamente.

2. Geração e enriquecimento de partículas lentivirais GFP

Os procedimentos experimentais para a geração e enriquecimento de partículas lentivirais GFP são descritos na Figura 1C (etapa 5).

1. Cultive HEK293T células com meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo 10% de FCS e prepare seis placas de 10 cm (2 x 10,⁶ células por placa) para o procedimento de transfecção seguinte.
2. Para transfecção por placa, prepare 500 μL da mistura, incluindo 20 μL do reagente de transfecção em DMEM com um vetor PRRL-GFP (5 μg) e dois plasmídeos de embalagem lentiviral, como pCMV-VSV-G (1 μg) e pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg), em um microtubo estéril de 1,5 mL. Mantenha a mistura em temperatura ambiente por 20 min e, em seguida, sobreponha-a em cada um dos pratos de 10 cm e incube-os por 18 h.
3. Retire o meio, adicione 5 mL de meio fresco 10% FCS-RPMI 1640 a cada prato e deixe repousar por 24 h.
4. Recolher o meio condicionado de cada cápsula para um tubo de centrifugação de 50 ml e armazenar um total de 30 ml do meio a 4 °C durante a noite. Adicione 5 mL do RPMI 1640 fresco em cada prato e deixe repousar por 24 h.
5. Recolher o meio condicionado de cada cápsula para um tubo de centrifugação de 50 ml e manter, no total, 30 ml do meio no gelo. Em seguida, descarte as células.
6. Filtre 60 mL do meio (das etapas 2,4-2,5) através de um filtro de 0,45 μm para remover as células e divida essa quantidade em doze tubos de centrífuga de polipropileno de 5 mL para ultracentrifugação.
7. Para concentrar os vírus, centrifugue-os usando um rotor de caçamba oscilante a 85.327 x g por 1,5 h a 4 °C.
8. Remova imediatamente o meio. Para resolver o pellet de vírus concentrado, coloque 250 μL de meio Nutrient Ham's Mixture F-12 (F12)/DMEM sem FCS em cada um dos doze tubos e mantenha-o a 4 °C durante a noite. Observe que o pellet de vírus geralmente é invisível.
9. Pipete suavemente o meio para coletar 3 mL do estoque concentrado de lentivírus GFP, no total, presumivelmente incluindo partículas lentivirais GFP com 10⁸ unidades de transdução por mL (TU / mL). Em seguida, armazene os doze microtubos de 1,5 mL (incluindo 250 μL por tubo) em condições estéreis a -80 ° C por até um ano. Prepare muitas alíquotas pequenas da solução original para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento.

3. Marcação de células organoides de CRC com partículas lentivirais GFP cultivadas em matriz extracelular artificial

Os procedimentos experimentais para marcar as células organoides do CRC com lentivírus GFP são descritos na Figura 1C (etapa 6).

1. Permita que os organoides CRC preparados na etapa 1.6 cresçam sem interferência por 7 a 10 dias, colha-os mecanicamente usando um raspador de células estéreis e transfira-os para um microtubo de 1,5 mL.
   nota: O crescimento de organoides de CCR em cultura depende da natureza dos tumores originais dos pacientes. Evite o crescimento excessivo dos organoides CRC, mantendo-os em 60-70% de confluência antes de transferir em uma proporção de divisão de 1:2 para uma nova placa artificial de 12 poços revestida com matriz extracelular.
2. Centrifugue o microtubo por 3 min a 1.400 x g, remova o meio de cultura e resolva o pellet celular em 500 μL de PBS batendo suavemente.
3. Centrifugue o microtubo por 3 min a 1.400 x g e elimine o PBS.
4. Para dissociar os organoides CRC aderentes, adicione 500 μL de uma solução de descolamento celular de enzimas proteolíticas e colagenolíticas ao pellet celular no tubo e misture-o batendo suavemente. Em seguida, deixe os tubos repousar por 10 min em temperatura ambiente.
5. Pipete muito suavemente a suspensão celular com 500 μL adicionais de FCS-DMEM a 1% várias vezes em um microtubo de 1,5 mL para dissociar aproximadamente as células. A geração de células únicas a partir dos organoides CRC por pipetagem severa reduz acentuadamente a viabilidade celular. Assim, é essencial deixar a massa de células visualmente detectável na suspensão celular, pipetando suavemente em um microtubo de 1,5 mL.
6. Centrifugue a suspensão da célula por 3 min a 1.400 x g e remova o sobrenadante.
7. Resolva o pellet celular com uma mistura de 100 μL de estoque de lentivírus 5x GFP (>10⁸ TU / mL) e 400 μL do meio de cultura organoide CRC em um microtubo de 1,5 mL batendo suavemente para ajustar a uma concentração de 5 x 10⁵ células tumorais dissociadas por 500 μL. Use um hemocitômetro para contar o número de células tumorais, incluindo células isoladas e grupos de células na suspensão celular, conforme descrito acima (etapa 1.3).
8. Prepare uma placa de 12 poços revestida com matriz extracelular artificial, conforme descrito na etapa 1.2. Em seguida, colocar 500 μL da suspensão celular preparada na etapa 3.7 na placa e deixá-la por 18 h a 37 °C sob 5% de CO₂.
9. Colete o meio com as células flutuantes separadas da placa revestida de matriz extracelular artificial em um tubo de centrifugação de 1,5 mL. Centrifugue-o a 1.400 x g e, em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 70 μL de matriz extracelular artificial no gelo.
10. Para aumentar a viabilidade das células CRC, sobreponha a matriz extracelular artificial contendo células tumorais nos organoides tumorais ligados à placa de 12 poços revestida com matriz extracelular artificial, conforme descrito na etapa 1.5. Em seguida, incube a placa por 30 min em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO₂ para solidificar o revestimento da matriz extracelular artificial e, em seguida, cultive-o com 1 mL do meio de cultura organoide CRC com 1% FCS a 37 ° C sob 5% de CO₂.
11. Observe as células três dias após a infecção sob um microscópio de fluorescência para confirmar quase 100% de positividade de GFP devido ao uso de um alto título de partículas lentivirais (ver Figura 2A).
12. Cultive os organoides CRC por 7 a 10 dias para expandir o crescimento celular antes da injeção em camundongos receptores.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática da geração de metástases pelos organoides CRC derivados de PDX marcados com lentivírus GFP em camundongos NOG.(A) Implantação de pequenos pedaços do tecido CRC por via subcutânea em camundongos NOG (etapa 1). O tecido do CCR dissecado cirurgicamente do paciente foi cortado em pedaços e implantado por via subcutânea em camundongos NOG. s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 12 poços	BMBio	#92412
microtubo	Eppendorf	#0030120086	Autoclave antes de usar
Hemocitômetro	Erma	#03-202-1
Matriz de membrana basal Matrigel	Corning	#354234	Armazene as alíquotas a -20 ° C. Coloque no gelo até o uso
Colagenase tipo 1	sigma	#C1030	150 mg/ml de colagenase tipo1 em 1×PBS. Armazene alíquotas a -20 ° C por até 1 ano
DMEM/F-12 com GlutaMAX™	Gibco	#10565018
penicilina	Gibco	#15140122	Conservar a 4°C. Utilizar no prazo de 1 mês
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	Armazene a -20 ° C. Adicione ao meio no mesmo dia do uso
Y27632, um inibidor de ROCK	Wako	#253-00591	Armazene a -20 ° C. Adicione ao meio no mesmo dia do uso
estreptomicina	Gibco	#15140122	Conservar a 4°C. Utilizar no prazo de 1 mês
Meio de cultura organoide CRC com 1% ou 5% FCS			DMEM/F-12 com suplemento GlutaMAX™ (Gibco #10565018) suplementado com 1% ou 5% de FCS, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 2 ng/ml de hEGF e 10 μM de Y27632, um inibidor de ROCK. Conservar a 4°C. Utilizar no prazo de 1 mês.
Vetor PRRL-GFP	Presente do Dr. Robert A. Weinberg
o regente de transfecção FuGENE 6	Roche	11814 443001
pCMV-VSV-G	Presente do Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Presente do Dr. Robert A. Weinberg
um microscópio de estereofluorescência Zeiss Axioplan 2	Zeiss