$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Dissecção de CRC PDXs de camundongos
Os procedimentos experimentais para dissecção de PDXs de CRC são descritos na Figura 1B (etapa 2).
- Permita que o tumor cresça subcutaneamente até ~ 1 cm3 de tamanho, o que geralmente leva aproximadamente 1-3 meses.
- Anestesie o camundongo com inalação de isoflurano usando o dispositivo de anestesia por inalação de pequenos animais e desinfete a pele com etanol a 70%.
- Coloque o mouse em decúbito ventral na bancada do laboratório. Incisar a pele, expor o tumor e separar cuidadosamente a pele do tumor usando uma tesoura estéril. Após a remoção do tumor, coloque-o em uma placa de Petri de 10 cm, remova todas as regiões grosseiramente necróticas do tumor e enxágue duas vezes com 5 mL de PBS.
nota: As áreas necróticas são frequentemente mais brancas, mais macias e mais friáveis do que as áreas circundantes.
- Coloque o tumor no gelo e divida-o igualmente em pelo menos 4 partes para diferentes aplicações, incluindo 1) a cultura organoide do CRC, 2) transplante em camundongos secundários, 3) exame histológico e 4) congelamento e armazenamento dos fragmentos do tumor.
- Para a geração dos organoides CRC, coloque o tecido tumoral sólido em uma placa de Petri de 6 cm contendo 1 mL de PBS estéril. Mantenha o tecido no gelo até o processamento.
- Para estabelecer o modelo PDX para CRC humano, passe os novos CRC PDXs para um camundongo secundário. Corte o tecido tumoral em pequenos pedaços (5 x 5 x5 mm 3 de tamanho) usando lâminas de barbear estéreis e mergulhe suavemente esses fragmentos de tecido em 50 μL de matriz extracelular artificial. Em seguida, implante esses fragmentos nas partes inferiores das bolsas subcutâneas direita e esquerda do camundongo OG.
- Coloque o mouse anestesiado em decúbito ventral na bancada do laboratório. Faça uma pequena incisão nas partes inferiores dos flancos direito e esquerdo do camundongo receptor para gerar bolsas subcutâneas para implantação de tecido usando tesouras estéreis. Tome cuidado para não perfurar a membrana peritoneal. Deve haver pouco sangramento com este procedimento.
- Mergulhe suavemente os fragmentos tumorais preparados acima em 50 μL de matriz extracelular artificial e, em seguida, implante-os nas partes inferiores das bolsas subcutâneas direita e esquerda.
- Suturar a incisão com clipes de ferida nos camundongos submetidos a procedimentos cirúrgicos. Certifique-se de que os tecidos tumorais implantados estejam localizados a alguma distância da incisão sob a pele.
nota: De acordo com a minimização dos procedimentos cirúrgicos, nenhum tratamento para dor e infecção pós-cirúrgica foi administrado neste estudo.
- Coloque o mouse em uma almofada quente e mantenha a posição reclinada esternal até que a consciência suficiente seja restaurada. Uma vez totalmente recuperados e capazes de se sentar nas quatro patas, os ratos podem ser devolvidos às suas gaiolas domésticas. Para evitar a predação, não permita a reprodução com animais não operados na mesma gaiola.
- Para análise histológica, fixar as amostras em 5 mL de formalina tamponada neutra a 10% em tubo cônico de 15 mL em temperatura ambiente por 2 dias.
- Para criopreservação, corte o tecido tumoral em pequenos pedaços (5 x 5 x 5 mmde tamanho 3) e mergulhe suavemente as amostras em 500 μL de solução de congelamento celular em tubos crioviais de 1-1,5 mL. Em seguida, transfira o tubo para um freezer a -80 °C.
2. Extração de PDXs na Suspensão Celular para a Cultura Organoide CRC
Os procedimentos experimentais para dissociação de CRC PDXs são descritos na Figura 1B (etapa 3).
- Coloque os fragmentos tumorais preparados acima (etapa 1.4.1) em uma placa de Petri de 10 cm.
- Pique os fragmentos usando lâminas de barbear estéreis e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL contendo 8 mL de soro fetal de bezerro a 10% (FCS) - Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 80 μL de estoque de enzima colagenase (ver Tabela de Materiais).
- Feche bem o tubo e envolva a tampa com parafilme para evitar vazamentos. Para dissociar os fragmentos tumorais picados na suspensão celular, agite-a suavemente por 2 h a 37 ° C. Observe que ainda haverá muitos fragmentos de tecido não digerido remanescentes no tubo.
- Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min a 4 °C e remover o sobrenadante. Resolva o pellet celular usando 10 mL de FCS-DMEM a 10% para fazer a suspensão celular.
- Para eliminar os restos teciduais não digeridos, filtre a suspensão celular duas vezes usando o filtro de células de 40 μm colocado em um tubo cônico de 50 mL. Em seguida, centrifugue o fluxo a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar o sobrenadante e manter o sedimento no gelo.
3. Geração de Organoides CRC Cultivados em Matriz Extracelular Artificial
Os procedimentos experimentais para a cultura do organoide CRC dos PDXs do cólon são descritos na Figura 1B (etapa 4).
- Estabelecer um meio de cultura adequado para os organoides CRC derivados de PDX (ver Tabela de Materiais, "o meio de cultura organoide CRC") empregando meios previamente descritos para organoides de cólon humano.
- Aplique 150 μL de matriz extracelular artificial (consulte a Tabela de Materiais) por poço em uma placa de 12 poços no gelo e, em seguida, incube-o por 30-60 min em uma incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% para solidificar os géis.
- Suspenda o pellet celular da etapa 2.5 com o meio de cultura organoide CRC (da etapa 3.1) com 5% FCS para obter o ajuste para 3 x 105 células/mL. Em seguida, semeie 1 mL do meio na placa revestida com matriz extracelular artificial preparada na etapa 3.2. e incubar durante a noite a 37 °C sob 5% de CO2. Use um hemocitômetro para contar o número de células tumorais, incluindo células únicas e aglomerados multicelulares (um grupo de células aderentes) na suspensão celular.
NOTA: 5% FCS é usado para extinguir a atividade enzimática residual da colagenase neste estudo.
- Colete cuidadosamente o meio de cultura, incluindo células flutuantes separadas da placa revestida com matriz extracelular artificial, em um tubo de centrífuga de 1,5 mL no dia seguinte e centrifugue-o a 1.400 x g por 5 min. Em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 70 μl de matriz extracelular artificial em gelo.
- Para aumentar a viabilidade das células CRC, sobreponha a matriz extracelular artificial contendo células tumorais nas células organoides tumorais ligadas à placa revestida com matriz extracelular artificial e incube por 30 min em uma incubadora de CO2 a 37 ° C, 5% solidifique o revestimento da matriz extracelular artificial. Em seguida, incube-o com 1 mL do meio de cultura de células organoides CRC com 1% de FCS a 37 °C sob 5% de CO2.
- Mude o meio de cultura a cada dois dias. À medida que os organoides CRC preenchem o meio, pode ser necessário trocar o meio diariamente.
4. Geração e Enriquecimento de Partículas Lentivirais GFP
Os procedimentos experimentais para a geração e enriquecimento de partículas lentivirais GFP são descritos na Figura 1C (etapa 5).
- Cultive HEK293T células com meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo 10% de FCS e prepare seis placas de 10 cm (2 x 10,6 células por placa) para o procedimento de transfecção seguinte.
- Para transfecção por placa, prepare 500 μL da mistura, incluindo 20 μl do reagente de transfecção em DMEM com um vetor PRRL-GFP (5 μg)12 e dois plasmídeos de embalagem lentiviral, como pCMV-VSV-G (1 μg) e pCMV-dR8,2 dvpr (5 μg), em um microtubo estéril de 1,5 mL. Mantenha a mistura em temperatura ambiente por 20 min e, em seguida, sobreponha-a em cada um dos pratos de 10 cm e incube-os por 18 h.
- Retire o meio, adicione 5 mL de meio fresco 10% FCS-RPMI 1640 a cada prato e deixe repousar por 24 h.
- Recolher o meio condicionado de cada cápsula para um tubo de centrifugação de 50 ml e armazenar um total de 30 ml do meio a 4 °C durante a noite. Adicione 5 ml do RPMI 1640 fresco em cada prato e deixe repousar por 24 h.
- Recolher o meio condicionado de cada cápsula para um tubo de centrifugação de 50 ml e manter, no total, 30 ml do meio no gelo. Em seguida, descarte as células.
- Filtre 60 mL do meio (das etapas 4.4-4.5) através de um filtro de 0.45 μm para remover as células e divida essa quantidade em doze tubos de centrífuga de polipropileno de 5 mL para ultracentrifugação.
- Para concentrar os vírus, centrifugue-os usando um rotor de balde oscilante (consulte a Tabela de Materiais) a 85.327 x g por 1,5 h a 4 ° C.
- Remova imediatamente o meio. Para resolver o pellet de vírus concentrado, coloque 250 μL de meio Nutrient Ham's Mixture F-12 (F12)/DMEM sem FCS em cada um dos doze tubos e mantenha-o a 4 °C durante a noite. Observe que o pellet de vírus geralmente é invisível.
- Pipete suavemente o meio para coletar 3 mL do estoque concentrado de lentivírus GFP, no total, presumivelmente incluindo partículas lentivirais GFP com 108 unidades de transdução por mL (TU / mL). Em seguida, armazene os doze microtubos de 1,5 mL (incluindo 250 μL por tubo) em condições estéreis a -80 ° C por até um ano. Prepare muitas alíquotas pequenas da solução original para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento.
5. Marcação de células organoides de CRC com partículas lentivirais GFP cultivadas em matriz extracelular artificial
Os procedimentos experimentais para marcar as células organoides do CRC com lentivírus GFP são descritos na Figura 1C (etapa 6).
- Permita que os organoides CRC preparados na etapa 3.6 cresçam sem interferência por 7 a 10 dias, colha-os mecanicamente usando um raspador de células estéreis e, em seguida, transfira-os para um microtubo de 1,5 mL.
nota: O crescimento de organoides de CCR em cultura depende da natureza dos tumores originais dos pacientes. Evite o crescimento excessivo dos organoides CRC, mantendo-os em 60-70% de confluência antes de transferir em uma proporção de divisão de 1:2 para uma nova placa artificial de 12 poços revestida com matriz extracelular.
- Centrifugue o microtubo por 3 min a 1.400 x g, remova o meio de cultura e resolva o pellet celular em 500 μL de PBS batendo suavemente.
- Centrifugue o microtubo por 3 min a 1.400 x g e elimine o PBS.
- Para dissociar os organoides CRC aderentes, adicione 500 μL de uma solução de descolamento celular de enzimas proteolíticas e colagenolíticas ao pellet celular no tubo e misture-o batendo suavemente. Em seguida, deixe os tubos repousar por 10 min em temperatura ambiente.
- Pipete muito suavemente a suspensão celular com 500 μL adicionais de FCS-DMEM a 1% várias vezes em um microtubo de 1,5 mL para dissociar aproximadamente as células. A geração de células únicas a partir dos organoides CRC por pipetagem severa reduz acentuadamente a viabilidade celular. Assim, é essencial deixar a massa de células visualmente detectável na suspensão celular, pipetando suavemente em um microtubo de 1,5 mL.
- Centrifugue a suspensão da célula por 3 min a 1.400 x g e remova o sobrenadante.
- Resolva o pellet celular com uma mistura de 100 μL de estoque de lentivírus 5x GFP (>108 TU / mL) e 400 μl do meio de cultura organoide CRC em um microtubo de 1,5 mL batendo suavemente para ajustar a uma concentração de 5 x 105 células tumorais dissociadas por 500 μl. Use um hemocitômetro para contar o número de células tumorais, incluindo células isoladas e grupos de células na suspensão celular, conforme descrito acima (etapa 3.3).
- Prepare uma placa de 12 poços revestida com matriz extracelular artificial, conforme descrito na etapa 3.2. Em seguida, colocar 500 μl da suspensão celular preparada no passo 5.7 na placa e deixá-la durante 18 h a 37 °C a 5% de CO2.
- Colete o meio com as células flutuantes separadas da placa revestida de matriz extracelular artificial em um tubo de centrifugação de 1,5 mL. Centrifugue-o a 1.400 x g e, em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 70 μl de matriz extracelular artificial no gelo.
- Para aumentar a viabilidade das células CRC, sobreponha a matriz extracelular artificial contendo células tumorais nos organoides tumorais ligados à placa de 12 poços revestida com matriz extracelular artificial, conforme descrito na etapa 3.5. Em seguida, incube a placa por 30 min em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 para solidificar o revestimento da matriz extracelular artificial e, em seguida, cultive-o com 1 mL do meio de cultura organoide CRC com 1% FCS a 37 ° C sob 5% de CO2.
- Observe as células 3 dias após a infecção sob um microscópio de fluorescência para confirmar quase 100% de positividade de GFP devido ao uso de um alto título de partículas lentivirais (ver Figura 2A).
- Cultive os organoides CRC por 7 a 10 dias para expandir o crescimento celular antes da injeção em camundongos receptores.
6. Geração de metástases por organoides CRC marcados com GFP em camundongos receptores
Os procedimentos experimentais para a geração de metástases usando os organoides CRC marcados com GFP são descritos na Figura 1C (etapa 7).
- Para dissociar os organoides CRC marcados com GFP na suspensão celular, colhe-os mecanicamente usando um raspador de células estéreis e transfira-os para um microtubo de 1,5 mL, conforme descrito acima (etapa 5.1).
- Centrifugue o microtubo por 3 min a 1.400 x g, remova o meio de cultura e resolva o pellet celular em 500 μL de PBS batendo suavemente.
- Centrifugue o microtubo por 3 min a 1.400 x g e elimine o PBS.
- Sobreponha 500 μL da solução de descolamento de células no pellet de células no tubo e misture-o batendo suavemente. Em seguida, deixe a mistura em repouso por 10 min em temperatura ambiente para dissociar enzimaticamente os organoides CRC aderentes, conforme descrito acima (etapa 5.4).
- Pipete muito suavemente a suspensão celular com 500 μL adicionais de FCS-DMEM a 1% várias vezes em um microtubo de 1,5 mL para dissociar aproximadamente as células, conforme descrito acima (etapa 5.5). A geração de células únicas a partir dos organoides CRC por pipetagem severa reduz acentuadamente a viabilidade celular. Assim, deixe a massa de células visualmente detectável na suspensão celular pipetando suavemente em um microtubo de 1,5 mL.
- Centrifugue a suspensão da célula por 3 min a 1.400 x g e remova o sobrenadante.
- Para estabelecer um modelo de camundongo com metástase espontânea de CRC PDXs:
- Preparar uma suspensão celular incluindo 5 x 105 células em 50 μL de PBS com 50% de matriz extracelular artificial por camundongo. Mantenha a suspensão no gelo antes de usar. Use um hemocitômetro para contar as células cancerígenas, conforme indicado na etapa 3.3.
- Anestesie um camundongo com inalação de isoflurano usando o dispositivo de anestesia por inalação de pequenos animais e desinfete a pele com etanol a 70%. Assegure a frequência normal e a profundidade da respiração e a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé para uma anestesia adequada. A pomada veterinária nos olhos é uma opção para prevenir o ressecamento ocular durante a anestesia.
- Coloque o camundongo NOG em decúbito dorsal na bancada do laboratório. Segure a mucosa retal com uma pinça estéril e puxe-a suavemente para fora do ânus. Em seguida, injete imediatamente a suspensão celular preparada na etapa 6.7.1 na submucosa retal do camundongo usando uma seringa (tamanho da agulha: 22 G). Rotineiramente, 4-6 camundongos por grupo são usados para avaliar os resultados.
