Estabelecendo modelo de camundongo com metástases experimentais: implantando células organoides CRC que expressam GFP no modelo PDX para detectar micrometástases

Resumo

Fonte: Okazawa, Y. et al. Detecção de alta sensibilidade de micrometástases geradas por organoides transduzidos por lentivírus GFP cultivados a partir de um tumor de cólon derivado de paciente. (2018).

Este vídeo descreve o protocolo para gerar metástases pelos organoides CRC derivados de PDX marcados com lentivírus GFP no baço de um camundongo imunodeficiente. As micrometástases de câncer que colonizam outros órgãos podem ser detectadas usando um microscópio de fluorescência para avaliar a expressão de GFP.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Geração de metástases por organoides CRC marcados com GFP em camundongos receptores

1. Para estabelecer um modelo experimental de metástase de CRC PDXs:
   1. Preparar uma suspensão de células organoides CRC incluindo 4 x 10⁴ células em 50 μL de PBS por ratinho. Mantenha a suspensão no gelo antes de usar. Use um hemocitômetro para contar as células cancerígenas. (Conte o número de células tumorais, incluindo células únicas e aglomerados multicelulares na suspensão celular).
   2. Anestesie um camundongo com inalação de isoflurano usando o dispositivo de anestesia por inalação de pequenos animais e desinfete a pele com etanol a 70%. Assegure a frequência normal e a profundidade da respiração e a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé para uma anestesia adequada. A pomada veterinária nos olhos é uma opção, para evitar o ressecamento ocular durante a anestesia.
   3. Coloque o camundongo NOG anestesiado em decúbito ventral na bancada do laboratório. Faça uma pequena incisão na parte inferior do flanco esquerdo e, em seguida, corte o peritônio para expor cuidadosamente o baço usando tesouras e pinças estéreis. Segure o tecido adiposo ligado ao baço com uma pinça estéril e, em seguida, injete lentamente 50 μL da suspensão celular (preparada como acima, etapa 1.1) no baço. Certifique-se de que a suspensão celular seja injetada adequadamente, sem vazamento para fora, do baço. Rotineiramente, 4 camundongos por grupo são usados para avaliar os resultados.
2. Coloque todos os camundongos em uma almofada quente após a cirurgia e mantenha-os em uma posição esternal reclinada até que a consciência suficiente seja restaurada. Uma vez que os ratos tenham se recuperado totalmente e sejam capazes de se sentar nas quatro patas , devolva-os às gaiolas de casa. Para evitar a predação, não permita a reprodução com animais não operados na mesma gaiola.
3. Verifique se há vazamento de sutura e confirme se os camundongos estão vivos, no grupo tratado cirurgicamente, no dia seguinte. Verifique os camundongos em busca de sinais de doença e meça o tamanho dos tumores, empregando paquímetros, em todos os camundongos uma vez por semana.
4. Observe camundongos para detectar metástase espontânea (por períodos de até 2,5 meses) e metástase experimental (1 mês) após a injeção.
5. Sacrifique os camundongos por meio de anestesia e luxação cervical nos dias indicados. Dissecar tumores primários e vários tecidos, incluindo fígado e pulmões. Coloque os tumores e órgãos dissecados em 5 mL de PBS gelado em uma placa de Petri de 10 cm e armazene-os no gelo.
6. Para detectar células organoides de CRC positivas para GFP, observe os tecidos dissecados sob um microscópio de estereofluorescência. Adquira imagens com uma câmera CCD e prepare-as usando um software de processamento de imagem padrão

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos NOD/Shi-scid IL2Rγ nulo (NOG)	Instituto Central de Animais Experimentais, Kanagawa, Japão	Raça de camundongos machos de 6 semanas de idade em condições livres de germes e patógenos específicos
clipes enrolados 2×10mm	Fabricação de Natsume, Japão	#C-21-S	Autoclave antes de usar
Tamanho da agulha da seringa Hamilton: calibre 22	Tokyo Science, Japão	Desinfete com álcool 70% e PBS estéril.
Tubo cônico de 50ml	Baquelite Sumitomo	MS-57500
microtubo	Eppendorf	#0030120086	Autoclave antes de usar
Hemocitômetro	Erma	#03-202-1
Meio de cultura organoide CRC com 1% ou 5% FCS			DMEM/F-12 com suplemento GlutaMAX™ (Gibco #10565018) suplementado com 1% ou 5% de FCS, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 2 ng/ml de hEGF e 10 μM de Y27632, um inibidor de ROCK. Conservar a 4°C. Utilizar no prazo de 1 mês.
um microscópio de estereofluorescência Zeiss Axioplan 2	Zeiss