Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Indução local de tumor via infecção cirúrgica por adeno-cre
- Preparação de animais para cirurgia
nota: Praticamente qualquer mutação condicional ("floxed") pode ser induzida através do método aqui descrito. Recomenda-se o uso de mutações em genes relevantes para o câncer colorretal, como Apc, Kras ou Tp53. A eficiência da recombinação de Cre depende do tamanho do construto a ser extirpado. Grandes sequências floxed são excisadas com menos eficiência. A recombinação de todos os alelos deve ser confirmada nos tumores por PCR.
- Para o desenvolvimento de tumores colorretais, use um cruzamento dos seguintes alelos condicionais para um modelo básico de CCR (número do banco de dados MGI entre parênteses):
Apctm2Rak (MGI: 3688435)
Krastm4Tyj (MGI: 2429948)
Tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)
- Se um alelo repórter de fluorescência for necessário (por exemplo, para detectar micrometástases), use o seguinte alelo:
Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI: 3809522)
nota: Todas as cepas acima estão disponíveis no NCI Mouse Repository ou no Jackson Laboratory. Não é necessário jejuar, pois toda a matéria fecal restante pode ser eliminada antes da infecção por adenovírus. O jejum pré-operatório leva a uma maior mortalidade perioperatória e constitui um tremendo estresse para pequenos roedores.
- Use sevoflurano a 3 - 3,5 vol% para anestesia geral. A perda do reflexo de pinça do dedo do pé indica anestesia suficiente.
- Antes da primeira incisão, injetar 0,05 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea.
- Cubra os olhos do camundongo anestesiado com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
- Coloque o mouse em decúbito dorsal em uma pequena mesa. Use fitas adesivas não traumáticas para conter o mouse.
- Depile o abdômen com um barbeador elétrico (creme depilatório pode ser usado alternativamente) e desinfete com compressas com álcool ou iodo. Use o tempo de contato recomendado pelo fabricante.
- Cubra o campo cirúrgico com campos estéreis.
nota: O uso de antibióticos perioperatórios é opcional e está sujeito a diretrizes institucionais.
- Use instrumentos estéreis de uso único ou esterilizados para todos os procedimentos cirúrgicos.
- Laparotomia da linha média e exposição do cólon
- Use uma tesoura (bisturis podem ser usados alternativamente) para fazer uma incisão na linha média (~ 15 mm) na pele da parte inferior do abdômen.
- Pegue a musculatura da parede abdominal com uma pinça e faça uma incisão cuidadosa com uma tesoura, abrindo a cavidade abdominal.
- Identifique o cólon distal, toque-o apenas com uma pinça atraumática. Clampeie o cólon com uma pinça delicada (por exemplo, uma pinça vascular Micro Serrefine) aproximadamente 15 mm proximalmente ao ânus.
nota: Dê atenção especial à vulnerabilidade do cólon em todos os momentos. A perfuração leva inevitavelmente à peritonite e sepse e requer a eutanásia do animal.
- Infecção segmentar do cólon pelo vírus Adeno-cre
- Insira um tubo flexível de Teflon transanal e avance-o cuidadosamente até atingir a oclusão do lúmen alcançada pela pinça previamente colocada a 15 mm da borda anal. Não use força excessiva, pois isso pode levar à perfuração.
- Canule o tubo com uma cânula 30G, conecte uma seringa padrão de 1 mL e lave o cólon com solução salina normal para evacuar a matéria fecal restante. Isso pode exigir vários mL de solução salina.
- Quando o cólon distal estiver vazio, remova o tubo e substitua-o por um novo tubo de Teflon e posicione-o novamente diretamente distal ao clamp conforme descrito acima.
- Oclua o cólon com uma segunda pinça ~ 3 mm distal à pinça proximal (ou seja, sobre o tubo inserido, ~ 12 mm da borda anal), resultando em um segmento isolado de 3 mm a ser infectado.
nota: Para a oclusão distal do segmento, os clipes de artéria coronária de Fogarty provaram ser os mais adequados, pois são emborrachados, levando à oclusão apertada do cólon, apesar do tubo intraluminal entre os ramos da pinça.
- Use uma segunda seringa (padrão 1 mL com uma cânula de 30G) para injetar cuidadosamente 50 - 80 μL de tripsina-EDTA a 0,25% no segmento do cólon clampeado e incube por 10 min. Deixe a cânula e a seringa presas ao tubo de Teflon para evitar que o fluido vaze de volta.
nota: O cólon deve ser inflado para romper a barreira mucosa e alcançar as células-tronco da cripta, mas não muito inflado para evitar a perfuração do segmento pinçado.
- Primeiro, remova o grampo distal e depois o tubo de tripsina.
- Lave o cólon distal com ~ 500 μL de solução salina normal para remover a tripsina restante.
- Insira um novo tubo de Teflon, coloque a pinça distal de volta no lugar e infle o segmento do cólon com 50 a 80 μL de solução adenoviral (1011 unidades formadoras de placa (UFP) / mL em solução salina tamponada com fosfato) e incube por 30 min (Figura 2A).
nota: Não derrame solução viral, pois o contato com adeno-cre pode levar ao desenvolvimento de tumor em qualquer tecido de camundongos condicionalmente mutantes.
- Remova o clamps e o tubo.
- Fechamento do abdômen e recuperação pós-operatória
- Feche a parede abdominal com suturas contínuas 6-0 rapidamente absorvíveis (por exemplo, polidioxanona (PDS)).
- Feche a pele com clipes de ferida cirúrgica.
- Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ajustada para 38 °C até que esteja totalmente recuperado da anestesia.
- Administre outro bolus de 0,05 mg / kg de buprenorfina i.p. 12 h após a cirurgia, seguido de bolus adicionais de buprenorfina a cada 12 h, se necessário.
- Monitore os camundongos pelo menos uma vez ao dia em busca de sinais de angústia devido ao crescimento do tumor.
2. Colonoscopia
NOTA: Dependendo das mutações condicionais usadas, a infecção adenoviral leva a tumores visíveis endoscopicamente dentro de 2 a 4 semanas. Portanto, realize a primeira colonoscopia pós-operatória 2 semanas após a indução adenoviral e repita a cada 2 semanas. Um sistema disponível comercialmente é recomendado para colonoscopia murina.
- Preparação de animais para colonoscopia
nota: Não é necessário jejum. A matéria fecal restante geralmente é bem formada no cólon distal e pode ser empurrada para além do tumor durante a colonoscopia, tornando desnecessário o processo estressante de jejum repetido.
- Use sevoflurano a 3 - 3,5 vol% para anestesia geral. A perda do reflexo de pinça do dedo do pé indica anestesia suficiente.
- Cubra os olhos dos camundongos anestesiados com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
- Contenha os ratos em decúbito dorsal em uma pequena mesa.
- Colonoscopia
- Insira o endoscópio (diâmetro 1,9 mm; comprimento 10 cm) no trato intestinal através do ânus e insufle cuidadosamente o ar sob controle visual para distender o cólon. Não insuflar mais ar do que o necessário para o exame.
nota: Para insuflação de ar, a bomba de ar antiembaçante do sistema de colonoscopia pode ser usada. Se nenhuma bomba de ar antiembaçante estiver disponível, qualquer outra bomba de ar com configurações de pressão muito baixa pode ser usada ou ar pressurizado com uma delicada válvula redutora de pressão. O dióxido de carbono (CO2) leva facilmente à acidose em pequenos roedores e, portanto, deve ser evitado.
- Empurre cuidadosamente o endoscópio para frente até que uma lesão mucosa no cólon distal possa ser identificada (Figura 1A - 1D).
- Salve imagens endoscópicas para avaliação posterior. Um sistema de pontuação endoscópica para tumores intraluminais foi descrito anteriormente.
- Remova cuidadosamente o osciloscópio e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ajustada para 38 °C até que ele se recupere totalmente da anestesia.
