1. Ensaio de ligação de microtúbulos
- Para o ensaio de ligação aos microtúbulos, adicione ~ 1 x 106 HCT 116 células em placas de cultura de tecidos de 100 mm contendo o meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. Após um dia de cultivo, as células atingirão 60-70% de confluência.
- Prepare 1X (2 mL) de tampão PEM de 10X tampão PEM armazenado a 4 ° C adicionando 20 μM (40 μL) de paclitaxel e 1 mM (20 μL) de GTP. Pegue o estoque de microtúbulos (MT) do freezer de -80 ° C e o estoque de trabalho de E. coli tau do freezer de -20 ° C.
- Prepare amostras conforme a Tabela 1.
- Incubar a 37 °C por 30 min. Ultracentrífuga a 25 °C por 60 min a 100.000 x g.
- Transfira 120 μL de sobrenadantes contendo tau não ligado para tubos limpos e rotulados.
- Adicione 120 μL (mesmo volume do sobrenadante) de tampão de amostra 5X ao pellet contendo tau ligado e misture bem. Transfira a solução para tubos limpos e rotulados e misture bem.
- Meça a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford usando kits comerciais de ensaio de proteína.
nota: Durante a preparação das amostras, utilizar o volume da solução (passo 1.6) para preparar as amostras do pellet e do sobrenadante.
- Prepare amostras de concentração de proteína equivalente e adicione tampão de carregamento de gel 4x SDS recém-preparado contendo DTT (400 mM).
nota: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C nesta fase.
- Incubar as amostras num bloco de calor a 100 °C durante 5 min. Misturar as amostras utilizando um vórtice. Deixe esfriar em temperatura ambiente por ~ 10-15 min.
- Monte um sistema de eletroforese para executar um gel de poliacrilamida a 10% por SDS-PAGE.
- Carregue 10 μg de proteína (amostra de 13 μL) por alvéolo em um gel de poliacrilamida a 10%. Carregue a escada de peso molecular.
- Depois de carregar a amostra, conecte os eletrodos positivo e negativo do sistema de eletroforese a uma fonte de energia para manter uma tensão constante. Inicialmente, comece em 70 V por 20 min para mover as amostras de proteína do gel de empilhamento para o gel de resolução. Em seguida, aumente a voltagem para 125 V e deixe o gel funcionar por aproximadamente 70-120 min até que as amostras e a escada de proteínas cheguem ao final do gel.
- Após a conclusão da eletroforese, transfira o gel para uma membrana de PVDF usando um sistema de eletroblotting úmido. Transfira por ~ 100 min a 100 V.
- Marque a mancha fazendo um pequeno corte na lateral da escada de peso molecular. Use uma folha de plástico transparente e um cortador afiado para cortar a mancha.
- Bloqueie a membrana em tampão de bloqueio BSA a 4% por 90 min em temperatura ambiente.
- Incubar o blot em solução de anticorpo primário (anti-tau a 1:5.000) a 4 °C durante a noite. Lave a mancha em PBST quatro vezes, por 7 min cada.
- Prepare a solução de anticorpo secundário relevante (IgG anti-camundongo de cabra a 1:5.000) e incube o blot por 90 min em temperatura ambiente. Lave em PBST quatro vezes, por 7 min cada.
- Desenvolva o blot usando um kit de quimioluminescência de acordo com as recomendações do fabricante. Cubra a mancha com filme plástico transparente. Adquira imagens por um sistema de imagem de quimioluminescência para quimioluminescência com software relevante.
Tabela 1: Preparação da amostra para ensaio de ligação de microtúbulos.
| amostra | nome | Microtúbulo necessário | Proteína principal necessária | PEM-GTP-PTX |
| 1 | HCT 116-Controle (6,21 μg/μl) | 2 μl | 9,66 μl (60 μg) | 108,34 μl |
| algarismo | HCT 116-Curcumina 10 μM (4,81 μg/μl) | 2 μl | 16,63 μl (80 μg) | 101,37 μl |
| 3 | HCT 116-Curcumina 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 30,49 μl (100 μg) | 87,51 μl |
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) | 2 μl | 18,42 μl (100 μg) | 99,58 μl |
| 5 | E. coli tau | 2 μl | 1 μl tau-352 | 117 μl |
| 6 | Somente MT | 2 μl | X | 118 μl |
| | | | 120 μl cada |
