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Artigo de método
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30 de abril de 2023
Fonte: Kochall, S., et al. Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo ortotópico de câncer colorretal em camundongos. J. Vis. Exp. (2017).
Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar células tumorais circulantes da amostra de sangue total de um modelo de camundongo com tumor colorretal sacrificado. Essas CTCs isoladas podem ser cultivadas e usadas para análise downstream pretendida.
Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Isolamento de células tumorais circulantes de amostras de sangue total
NOTA: Obter sangue por punção cardíaca transcutânea em camundongos anestesiados, seguida de eutanásia. Idealmente, 1.000 μL de sangue são aspirados para uma seringa pré-cheia com 100 μL de um anticoagulante (ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou heparina). Use um anticorpo anti-EpCAM humano (molécula de adesão de células epiteliais) para identifi....
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Gradiente de densidade médio – Ficoll | Células-tronco - Lymphoprep | Pedido 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-humano CD326 (EpCAM) Anticorpo clone 9C4 | BioLegend | Rolamento 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Anticorpo clone G8.8 | BioLegend | Rolamento 118210 | |
| Placa de Petri, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Ventilação | Greiner bio-one | 628102 | |
| Microscópio de cultura de células de fluorescência | Leica | ||
| Micromanipulador Transferman 4r | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | bomba de aspiração conectada ao micromanipulador | |
| Extrator de Microeletrodo Universal Dmz | Corporação Dagan | necessário para a fabricação de microcapilares para aspiração de célula única | |
| Capilares de vidro prismático | Corporação Dagan | ||
| Caneta PAP | Abcam | ||
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco | Life Technologies GmbH | 14190169 | escolhendo buffer |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | escolhendo buffer |
| Penicilina / estreptomicina (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | escolhendo buffer |
| Edta | Roth | 8040.1 | escolhendo buffer |
| Imuno-histoquímica | |||
| Clone purificado 9C4 do anticorpo anti-humano CD326 (EpCAM) | BioLegend | 324201 | Imuno-histoquímica de EpCAM |
| HRP coelho anti-rato IgG | Abcam | AB97046 | Imuno-histoquímica de EpCAM |
