Isolamento CTC de uma amostra de sangue total: um método para obter CTCs de modelo de câncer colorretal murino

Resumo

Fonte: Kochall, S., et al. Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo ortotópico de câncer colorretal em camundongos. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar células tumorais circulantes da amostra de sangue total de um modelo de camundongo com tumor colorretal sacrificado. Essas CTCs isoladas podem ser cultivadas e usadas para análise downstream pretendida.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Isolamento de células tumorais circulantes de amostras de sangue total

NOTA: Obter sangue por punção cardíaca transcutânea em camundongos anestesiados, seguida de eutanásia. Idealmente, 1.000 μL de sangue são aspirados para uma seringa pré-cheia com 100 μL de um anticoagulante (ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou heparina). Use um anticorpo anti-EpCAM humano (molécula de adesão de células epiteliais) para identificar as CTCs. Isso funciona muito bem se linhagens de células epiteliais humanas forem usadas no modelo de camundongo. Para outras aplicações, podem ser necessários anticorpos diferentes.

1. Enriquecimento CTC:
   1. Encha previamente os tubos de 15 mL com um gradiente de densidade de 5 mL e transfira cuidadosamente o sangue para o tubo de 15 ml.
   2. Centrifugue (30 min a 300 x g sem freio) e remova cuidadosamente o sobrenadante superior.
   3. Despeje o restante em um novo tubo de 15 mL e centrifugue (15 min, 300 x g com freio).
   4. Recupere a interfase que contém as células mononucleares (descarte o resto) e lave as células duas vezes com PBS.
   5. Ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS/1% de EDTA e adicione 4 μL de anticorpo EpCAM. Incube 20 min no gelo no escuro.
2. Triagem e separação
   1. Prepare o seguinte tampão (a seguir referido como tampão de coleta): PBS + 10% de soro fetal de bezerro (FCS) + 1% de penicilina/estreptomicina (1%) + 0,8% de EDTA.
   2. Use uma caneta PAP para desenhar um círculo de ~ 1 cm em uma placa de Petri estéril de 6 cm (evita que o fluido se disperse na placa) e pipete 700 μL de tampão de coleta neste círculo.
   3. Adicione 50 μL de suspensão celular ao buffer de coleta de 700 μL dentro do círculo. Verifique a densidade das células com o microscópio. Divida a amostra em pratos diferentes se for muito densa.
   4. Aguarde até que as células se acalmem (~5 min).
   5. Filtre a gota da suspensão celular para células coradas (= EpCAM-positivas).
   6. Assim que uma célula for encontrada, escolha a célula com o micromanipulador e coloque-a em um tampão de 50 μL, dependendo da análise a jusante pretendida (por exemplo, tampão de extração de RNA ou meio de cultura).
   7. Dependendo das análises a jusante pretendidas, isolar as células e/ou o meio negativos para EpCAM como controlos negativos.
   8. Prossiga com as análises a jusante (por exemplo, cultura de células, PCR).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gradiente de densidade médio – Ficoll	Células-tronco - Lymphoprep	Pedido 7801
Alexa Fluor 488 anti-humano CD326 (EpCAM) Anticorpo clone 9C4	BioLegend	Rolamento 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Anticorpo clone G8.8	BioLegend	Rolamento 118210
Placa de Petri, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Ventilação	Greiner bio-one	628102
Microscópio de cultura de células de fluorescência	Leica
Micromanipulador Transferman 4r	Eppendorf
CellTram Air	Eppendorf		bomba de aspiração conectada ao micromanipulador
Extrator de Microeletrodo Universal Dmz	Corporação Dagan		necessário para a fabricação de microcapilares para aspiração de célula única
Capilares de vidro prismático	Corporação Dagan
Caneta PAP	Abcam
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	Life Technologies GmbH	14190169	escolhendo buffer
Soro fetal de bezerro (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	escolhendo buffer
Penicilina / estreptomicina (PenStrep)	Life Technologies GmbH	15140122	escolhendo buffer
Edta	Roth	8040.1	escolhendo buffer
Imuno-histoquímica
Clone purificado 9C4 do anticorpo anti-humano CD326 (EpCAM)	BioLegend	324201	Imuno-histoquímica de EpCAM
HRP coelho anti-rato IgG	Abcam	AB97046	Imuno-histoquímica de EpCAM