Microdissecção a laser: uma técnica para isolar células invasoras de câncer colorretal a partir de um modelo de cultura organotípica 3D

Resumo

Fonte: Bullock M. et al., Perfil molecular do microambiente tumoral invasivo em um modelo tridimensional de células cancerígenas colorretais e fibroblastos ex vivo. (2014).

O vídeo descreve a dissecção a laser do modelo de cocultura organotípica 3D com precisão em nível de mícron. Em modelos organotípicos 3D, constituintes estromais, como fibroblastos, são co-cultivados tridimensionalmente com células epiteliais cancerígenas. O modelo 3D serve como uma ferramenta experimental que permite que as interações entre invasão e estroma de câncer sejam estudadas em condições quase fisiológicas.

Protocolo

1. Preparação organotípica:

Preparação do gel organotípico impregnado com fibroblastos:

1. Preparar uma suspensão de células de fibroblastos contendo 5 x 10⁵ células por organotípico em DMEM suplementada com 10% de FCS e 292 μg/ml de L-Glutamina.
2. Completar os géis organotípicos em gelo nas seguintes proporções:
   • • 7 volumes de Rat-Tail Collagen: Mistura de Matrigel (1:1)
   • • 1 volume de DMEM 10x filtrado
   • • 1 volume de FCS
   • • 1 volume de suspensão de células de fibroblastos contendo 5 x 10⁵ fibroblastos
     Para 9 géis (1 ml por gel), prepare 10 ml e misture delicadamente para evitar bolhas.
3. Adicione 1 ml a cada alvéolo de uma placa de 24 poços e incube por 1 hora a 37 °C em uma atmosfera umidificada para permitir que os géis endureçam. Após 1 hora, adicione 1 ml de DMEM (10% FCS)/Glut em cima dos géis e retorne à incubadora durante a noite.
4. No dia seguinte, aspire o meio da parte superior dos géis e coloque 1ml de meio contendo 5 x 10⁵ células epiteliais do CRC.

Preparação de folhas de nylon revestidas com gel:

5. Prepare folhas de nylon esterilizadas e autoclavadas medindo 1,5 cm x 1,5 cm com antecedência.
6. Usando uma pinça estéril, coloque o número necessário de folhas de náilon em uma placa de cultura de 10 cm (geralmente 4 folhas de náilon podem ser acomodadas por placa).
7. Gel de maquiagem no gelo na seguinte ordem (250 μl de volume total é necessário por folha de nylon):
   • • 7 volumes de colágeno de cauda de rato
   • • 1 volume de DMEM 10x filtrado
   • • 1 volume de FCS
   • • 1 volume de DMEM 10% FCS/Glut
8. Se a solução for amarela, neutralizar adicionando 0,1 M de NaOH em alíquotas de 50 μl até que a solução fique rosada.
9. Adicionar 250 μl desta solução a cada folha de nylon e incubar a 37 °C numa atmosfera humidificada de CO₂ a 5% durante 30 min para permitir que o gel endureça.
10. Maquiagem solução de glutaraldeído a 1% em PBS. Adicionar 10 ml a cada placa de cultura de 10 cm depois de o gel ter endurecido e incubar a 4 °C durante 1 hora.
11. Lave as folhas de nylon 3x em PBS e 1x em DMEM (10% FCS)/Glu e incube durante a noite em DMEM/Glu a 4 °C.

Criação de géis organotípicos em grades de aço para invasão:

12. Pré-prepare as grades de andaimes dobrando as chapas de aço inoxidável em uma formação de tripé. Autoclave antes de usar.
13. Use uma pinça esterilizada em etanol para colocar uma grade de aço em cada poço de uma placa de seis poços.
14. Coloque uma folha de nylon revestida com gel com o lado de colágeno voltado para cima, em cada grade.
15. Transfira cuidadosamente os géis organotípicos da placa de 24 poços para a folha de náilon elevada usando uma espátula esterilizada em etanol.
16. Encha o poço com DMEM 10% FCS/Glut suplementado com 10% FCS até que a folha de nylon esteja em contato com o meio, mas não submersa. Certifique-se de que o meio não toque no gel organotípico.
17. Incubar durante 14 dias a 37 °C numa atmosfera humidificada de 5% de CO₂, substituindo o meio de forma a cada 2 dias.

2. Fixação organotípica

1. Remova todo o organotípico, incluindo a folha de náilon, do poço e coloque sobre o filme plástico.
2. Folha organotípica e de nylon usando um bisturi descartável limpo e fixe ambas as metades em formaldeído por 24 horas em temperatura ambiente.
3. Substitua o formaldeído por etanol a 70% após 24 horas e deixe durante a noite antes de incorporar em parafina, seccionamento e coloração.

3. Microdissecção a laser da margem invasiva

1. Corte até 10 μm de espessura em lâminas montadas em membrana.
2. Desparafinize as seções aplicando xileno por 1 min, depois remova o xileno e fixe o etanol a 75% por mais 1 min.
3. Remova o etanol e manche com solução de Cresyl Violet a 0,125% por 1 min. Cresyl Violet destaca as células epiteliais e permite fácil discriminação do estroma.
4. Remova o Cresyl Violet e aplique 100% de etanol por mais 1 min antes de enxaguar com 100% de etanol. Deixe os slides secarem ao ar por 30 min.
5. Realize a microdissecção a laser usando a plataforma escolhida (por exemplo, o sistema Leica AS).
6. Coloque a lâmina de vidro com a seção manchada a ser microdissecada voltada para baixo no microscópio stage.
7. Monte um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml no de coleta e adicione 50 μl de tampão de lise celular (por exemplo, DNA, RNA ou tampão de lise de proteína) à tampa na qual o tecido microdissecado será coletado.
8. Sob visão direta, use o joystick para identificar o tecido de interesse. Usando a interface do software, anote a seção orgânica corada, destacando as células a serem microdissecadas na frente de invasão do tumor.
9. Instrua o laser a disparar, o que deve cortar a seção destacada e impulsionar o tecido microdissecado para dentro da tampa do tubo da microcentrífuga.
10. Uma vez coletado material suficiente, ejete o de coleta, feche o tubo de microcentrífuga e gire suavemente para puxar o tampão de lise para o fundo do tubo.
11. Coloque as amostras no gelo até que a microdissecção esteja completa. Processar as amostras por um método adequado para extrair a substância a analisar em causa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linhas celulares de câncer colorretal - exemplo mostrado SW480	ATCC	ATCC CCL-228
colagénio	BD Biociências	354265
Matrigel	BD Biociências	354234
Membrana de nylon	Merck Millipore	VVLP01300
Grade metálica	A empresa de malha	WSS20-A4	themeshcompany.com
Plataforma de microdissecção a laser	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Lâminas montadas em membrana	Dispositivos moleculares
Violeta Cresyl	Merck Millipore	1052350025