Ensaio de citometria de tração: um método para quantificar a força de tração exercida por células cancerígenas na ECM

Abstract

Fonte: Ali, M. Y., et al. Isolamento de células tumorais primárias do cólon humano de tecidos cirúrgicos e cultura-as diretamente em substratos elásticos macios para citometria de tração. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo descreve o ensaio de microscopia de força de tração. O ensaio determina a tração celular das células cancerígenas do cólon humano na matriz extracelular presente no hidrogel elástico macio com esferas fluorescentes incorporadas. O deslocamento resultante de grânulos fluorescentes é medido usando um software apropriado.

Protocol

1. Ensaio de Microscopia de Força de Tração

1. Aqueça a solução de tripsina-EDTA/SDS a 10% a 0,25% a 37 °C em banho-maria por 10 minutos antes do início dos experimentos de tração.
2. Remova um gel (Funcionalize géis de PA e vidro com moléculas de ECM, fibronectina humana a uma concentração de 50 μg/ml) da incubadora de cultura de células em um momento e local no microscópio invertido fluorescente stage (ampliação de 32X).
3. Encontre uma única célula no campo de visão. Remova a tampa da placa de Petri.
4. Tire uma imagem de contraste de fase da célula (por exemplo, Figura 1).
5. Mude o modo de imagem para fluorescência e selecione o filtro apropriado. Não mova o estágio do microscópio ou a amostra durante esse período.
6. Tire uma imagem das esferas fluorescentes deslocadas pela tração celular (Figura 2C).
7. Adicione 1 ml de solução de tripsina / SDS à placa de Petri para separar a célula do gel. Não mova o estágio do microscópio ou a amostra durante esse período. Além disso, tire uma imagem de controle da célula para garantir a remoção completa do gel.
8. Pegue uma imagem de referência (força nula) das contas depois que a célula for removida.
9. Repita as etapas 1.2-1.8 para todos os outros géis.
10. Faça uma pilha de imagens usando ImageJ a partir das duas imagens adquiridas nas etapas 1.6 e 1.8 para cada caso. Para gerar a pilha de imagens, use a seguinte sequência de comandos no ImageJ depois de abrir as imagens: Pilhas de → de imagem → Imagens a serem empilhadas.
11. Para obter o campo de deslocamento e tração, use os plug-ins do ImageJ seguindo os métodos publicados. Obtenha códigos e tutoriais detalhados para esses plug-ins usando o seguinte link: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. Alinhe as imagens na pilha usando o plug-in 'Template Matching'. Use a seguinte sequência de comandos no ImageJ depois de abrir a pilha de imagens gerada na etapa 1.10: Plugins → Correspondência de modelos → Alinhar fatias na pilha → OK. Salve a pilha de imagens consequentemente. Use essa nova pilha de imagens nas etapas a seguir.
    2. Obtenha o campo de deslocamento usando o plugin PIV (velocimetria de imagem de partículas) (Figura 2D). Use a seguinte sequência de comandos após abrir a pilha de imagens salva na etapa 1.11.1: Plug-ins → PIV → PIV iterativo (básico) → OK → Aceite este PIV e a saída → Ok. Salve a saída PIV no mesmo diretório da pilha de imagens original. Use isso como entrada na próxima etapa.
    3. Por fim, use o plug-in FTTC (citometria de tração com transformada de Fourier) para obter o mapa de tração (Figura 2E). Use a seguinte sequência de comandos: Plug-ins → FTTC → Insira as propriedades do material, ou seja, o módulo de Young e a proporção de Poisson do gel PA → OK → Selecione o arquivo de saída PIV salvo na etapa 1.11.2 → OK. Salve os resultados do FTTC no mesmo diretório da pilha de imagens e da saída PIV.

Results

Figura 1. Cultura de células primárias de cólon humano bem-sucedida (câncer e normal) em diferentes géis de rigidez e em placa de poliestireno. As imagens de contraste de fase mostram a morfologia típica de (A) células tumorais e (B) células normais em diferentes substratos de rigidez.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pbs	Lonza	17-516F
tripsina	Worthington	LS003736
acrilamida	Sigma-Aldrich	Rolamento A4058
N-metilenobisacrilamida (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
Fibronectina humana	BD biociências	354008
Esferas fluroscentes de 0,1 μm	Tecnologias de vida	Rolamento F8801
0,25% de tripsina-EDTA	Tecnologias de vida	Rolamento 25200-056
12 lamínulas de vidro mm2	Corning	2865-12