Ensaio de Organização de Citoesqueleto e Adesão Focal: Um Método Baseado em Imunofluorescência para Estudar a Adesão e Espalhamento Celular em Substratos

Resumo

Fonte: Ali, M. Y et al., Isolamento de células tumorais primárias do cólon humano de tecidos cirúrgicos e cultura-las diretamente em substratos elásticos macios para citometria de tração. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo descreve a técnica de estudo do citoesqueleto e aderências focais em células primárias de câncer de cólon humano para entender suas variações dependendo da rigidez do substrato. Esta cultura de células cancerígenas em substratos moles e duros permite várias medições biofísicas a jusante para o prognóstico do câncer.

Protocolo

1. Ensaios de Microscopia de Imunofluorescência

1. Pegue os substratos com células a serem imunomarcadas para a capa laminar e remova os meios de cultura.
2. Enxágue os substratos com PBS e fixe as células com paraformaldeído a 4% em PBS por 20 min em RT.
3. Lave os substratos com PBS três vezes (5 min de cada vez). Consequentemente, incubar os substratos com 500 μl de intensificador de sinal por 30 min e enxaguar com PBS.
4. Incubar células com o anticorpo monoclonal anti-vinculina em uma diluição de 1:250 em PBS por 45 min em RT. Em seguida, lave os substratos com PBS 3 vezes (5 min de cada vez).
5. Incubar as amostras com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG em uma diluição de 1:200 em PBS em RT por 30 min. Lave os substratos com PBS 3 vezes (5 min de cada vez).
6. Para visualizar a estrutura da F-actina, incube as células com conjugados de faloidina TRITC a uma concentração de 50 μg/ml por 45 min em RT. Em seguida, lave os substratos com PBS 3 vezes (5 min de cada vez).
7. Visualize as amostras usando um microscópio confocal a laser de varredura (Figura 1A-1D).

Resultados

Figura 1. Coloração imunofluorescente de F-actina e vinculina em substratos de gel mole e poliestireno duro.Nenhuma fibra de actina estava presente na célula tumoral (A1) menos disseminada ou na célula normal (A2) em géis moles de 2 kPa. No entanto, aderências focais pontilhadas contendo vinculina estão presentes em géis moles (B1-B2).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Pbs	Lonza	17-516F
Paraformaldeído	Ciências da Microscopia Eletrônica	RT15710
Intensificador de sinal	Tecnologias de vida	I36933
Anticorpo monoclonal anti-vinculina	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG	Tecnologias de vida	A11001
Conjugados de faloidina TRITC	Sigma-Aldrich	Pág. 1951
materiais
12 lamínulas de vidro mm2	Corning	2865-12