Ensaio de Organização de Citoesqueleto e Adesão Focal: Um Método Baseado em Imunofluorescência para Estudar a Adesão e Espalhamento Celular em Substratos

1. Ensaios de Microscopia de Imunofluorescência

1. Pegue os substratos com células a serem imunomarcadas para a capa laminar e remova os meios de cultura.
2. Enxágue os substratos com PBS e fixe as células com paraformaldeído a 4% em PBS por 20 min em RT.
3. Lave os substratos com PBS três vezes (5 min de cada vez). Consequentemente, incubar os substratos com 500 μl de intensificador de sinal por 30 min e enxaguar com PBS.
4. Incubar células com o anticorpo monoclonal anti-vinculina em uma diluição de 1:250 em PBS por 45 min em RT. Em seguida, lave os substratos com PBS 3 vezes (5 min de cada vez).
5. Incubar as amostras com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG em uma diluição de 1:200 em PBS em RT por 30 min. Lave os substratos com PBS 3 vezes (5 min de cada vez).
6. Para visualizar a estrutura da F-actina, incube as células com conjugados de faloidina TRITC a uma concentração de 50 μg/ml por 45 min em RT. Em seguida, lave os substratos com PBS 3 vezes (5 min de cada vez).
7. Visualize as amostras usando um microscópio confocal a laser de varredura (Figura 1A-1D).

Figura 1. Coloração imunofluorescente de F-actina e vinculina em substratos de gel mole e poliestireno duro.Nenhuma fibra de actina estava presente na célula tumoral (A1) menos disseminada ou na célula normal (A2) em géis moles de 2 kPa. No entanto, aderências focais pontilhadas contendo vinculina estão presentes em géis moles (B1-B2). Por outro lado, as células primárias mostram morfologia bem espalhada, fibras de estresse de actina bem definidas (C1-C2) e aderências focais alongadas discretas (D1-D2) em substratos rígidos de poliestireno.