Preparação de Bloqueio de Tecido de Pele Congelada: Um Protocolo para Preservar Amostras de Melanoma Cutâneo da Pele Dorsal Murina

Neste artigo

Resumo

Fonte: Moon, H., et al. Controle Espacial e Temporal da Iniciação do Melanoma Murino a partir de Células-Tronco de Melanócitos Mutantes. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve o protocolo detalhado para isolar a pele dorsal murina contendo melanoma, seguido de crio-incorporação para preparar um bloco de tecido cutâneo congelado. O bloco de tecido crioincorporado pode ser seccionado e examinado microscopicamente para estudar a progressão do melanoma.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Processamento de Tissue

Isolamento de pele
1. Antes de começar, obtenha o seguinte: instrumentos de necropsia, papel de filtro e toalhas de papel.
2. Eutanasiar os camundongos de acordo com os protocolos aprovados e confirmar a morte antes de prosseguir.
3. Usando um aparador de cabelo, raspe qualquer cabelo da área dorsal da pele. Pincele levemente a área com um lenço de papel sem fiapos para limpar a área.
4. Faça uma pequena incisão com uma tesoura afiada logo acima da base da cauda.
5. Insira uma tesoura grande e romba na incisão e separe os tecidos conjuntivos subdérmicos.
6. Isole cuidadosamente a região da pele de interesse cortando com uma tesoura afiada ao longo da borda do tecido.
7. Coloque o tecido da pele em uma toalha de papel limpa e use uma pinça cega para esticar a pele de modo que ela adira à toalha e fique esticada. Esta etapa serve para fornecer suporte adicional ao tecido para que ele possa ser manipulado e processado, mantendo sua forma.
  nota: Tenha cuidado para manusear apenas as regiões externas do tecido da pele, pois a pinça pode causar danos à pele que podem ser vistos histologicamente.
Fixação tecidual
1. Dobre um pedaço de papel de filtro ao meio e rotule adequadamente. Coloque a pele junto com o papel toalha no papel dobrado imediatamente adjacente ao vinco, garantindo que a amostra esteja lisa e não dobrada ou amassada. Sele o papel de filtro grampeando os lados abertos e, em seguida, corte para que o papel restante possa ser usado para amostras futuras.
  nota: Esta etapa é realizada para que a pele mantenha sua forma durante a fixação.
2. Mergulhe totalmente a amostra de tecido em formalina tamponada neutra a 10% por 3 a 5 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
3. Após a fixação, retirar as amostras da formalina, lavar em água deionizada (2x 5 min cada) e proceder à confecção dos blocos de tecido. Remova cuidadosamente qualquer material residual do tecido da pele (ou seja, papel residual).
Fazendo blocos de tecido congelado (Figura 1)
1. Apare as bordas da amostra de pele para que não fiquem irregulares e, em seguida, faça 3 cortes sagitais. A largura dessas tiras não deve ser superior à altura do criomold (5 mm). Em seguida, faça cortes transversais para ter pedaços de pele que não sejam maiores que a largura do criomold (20 mm) e possam ser embutidos. Repita com a metade restante da pele dorsal ou guarde o tecido para outros usos (alternadamente, guarde a metade antes da fixação).
  nota: É importante manter os pedaços de pele na orientação adequada.
2. Oriente o criomold (25 x 20 x 5 mm³) na orientação retrato e coloque 4 a 5 pedaços de pele em cima da OCT. Quando todas as peças estiverem no lugar, use 2 pares de pinças finas para trazer a borda longa da pele para o fundo do criomolde. A pele agora deve estar em pé na OCT perpendicular à base do molde. Tome cuidado para minimizar a formação de bolsas de ar dentro da OCT durante esta etapa (Figura 1).
3. Encha o molde com OCT até o segundo lábio e coloque-o na superfície plana de gelo seco. Use uma pinça para ajustar quaisquer pedaços de pele que possam ter se deslocado durante a transferência quando o bloco começar a congelar. Uma vez que a camada inferior esteja solidificada, a manipulação dos tecidos será impossível.
4. Corte lâminas de 8-10 μm para análise.
Fazendo blocos de tecido embebidos em parafina fixa de formalina (FFPE)
1. Coloque 2 pedaços de pele fixa em um rotulado e desidrate em concentrações crescentes de etanol (etanol 75% por 30 min, 85% por 30 min, 90% por 30 min, 95% por 30 min, 100% por 2x 30 min, xileno ou substituto de xileno por 2x 30 min). Incubar com parafina a 58-60 ° C, primeiro por 30 min e depois durante a noite.
2. Incorpore o tecido em um molde de tecido de aço inoxidável²⁴ x 24 mm 2 com parafina líquida e solidifique a -5 °C. A orientação do tecido deve ser semelhante à dos blocos de tecido congelados para que os cortes longitudinais em vários folículos pilosos possam ser visualizados (Figura 1).
3. Assim que a parafina solidificar, remova o molde e corte-o em seções de 5 a 10 μm para análise.

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Resultados

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Figura 1: Isolamento do tecido cutâneo e crio-incorporação. Após a eutanásia, raspar a região da pele dorsal do rato de interesse e incorporar a pele em criomold contendo OCT. A linha pontilhada no mouse representa a linha média. Normalmente, 3 ou 4 pedaços de pele podem ser isolados com segmento de linha 3-4 ao longo da linha média; uma dessas peças é indicada por um retângulo 1/2/3/4. Esses pedaços...