Modelagem de Xenoenxerto Derivado de Paciente: Uma Técnica para Gerar Modelos de Camundongos de Melanoma

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Processamento de tecido tumoral para implantação em camundongos

1. Excisão cirúrgica ou processamento de tecido de biópsia cirúrgica
   1. Transfira o tecido para uma placa de Petri estéril e separe o tecido tumoral do tecido normal circundante o máximo possível.
   2. Remova o tecido necrótico (geralmente identificado como tecido esbranquiçado pálido localizado centralmente dentro do tumor) do tumor remanescente o máximo possível.
   3. Use um bisturi para subdividir um pedaço inicial do tumor em pedaços aproximadamente iguais (~ 3 mm x 3 mm) para implante cirúrgico em camundongo (Figura 1).
   4. Opcionalmente, se houver tecido tumoral suficiente disponível, congele o tecido para ensaios a jusante (sequenciamento de RNA [RNASeq], sequenciamento completo do exoma [WES], etc.).
   5. Faça uma pasta tumoral picando o tecido tumoral usando uma técnica de lâmina cruzada com duas lâminas de bisturi. Pique os pedaços de tumor o mais finamente possível para formar uma pasta, que agora está pronta para implantação cirúrgica em camundongos.
   6. Alternativamente, se o tecido tumoral for muito duro para a dissociação mecânica, use um procedimento de dissociação da digestão para formar uma pasta semelhante a um gel e uma suspensão unicelular para implantação e / ou injeção.
      1. Pique os pedaços de tumor o mais finamente possível para formar uma pasta.
      2. Colocar a pasta num tubo de 50 ml com solução salina balanceada de Hank fria (HBSS)^-/- (sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺); em seguida, centrifugar o pellet a 220 x g durante 4 min a 4 °C.
      3. Ressuspenda a pasta em 10 mL de meio de digestão fresco aquecido (200 U / mL de colagenase IV + 5 mM CaCl₂ + 50 U / mL DNase em HBSS ^{- / -}) por 1g de tecido tumoral.
      4. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C por 20 min e misture vigorosamente a cada 5 min com uma pipeta descartável.
      5. Lavar com até 50 ml de HBSS^-/-; em seguida, centrifugar a 220 x g durante 4 min a 4 °C.
      6. Adicione 5 mL de TEG pré-aquecido (0,025% de tripsina + 40 μg/mL de etilenoglicol-bis(β-éter aminoetílico)-N,N,N',N'-ácido tetracético [EGTA] + 10 μg/mL de álcool polivinílico [PVA]) por 1 g de tecido tumoral, ressuspenda/agite suavemente e coloque o tubo a 37 °C por 2 min sem misturar.
      7. Adicione pelo menos 1 volume igual de meio de coloração a frio (albumina de soro bovino a 1% [BSA] + 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico [HEPES] + 1x penicilina-estreptomicina em meio L15) para extinguir a tripsina e centrifugue a 220 x g por 4 min a 4 °C.
      8. Ressuspenda a amostra em 10 mL de meio de coloração por 1g de tecido tumoral e filtre-a através de um filtro de células de 40 μm para obter uma suspensão de célula única para injeção em camundongos (Figura 1).
      9. A pasta restante no topo do filtro de células também pode ser coletada para implantação cirúrgica em camundongos.
2. Implantação e injeção de tumor em camundongos
   1. Implante de excisão cirúrgica ou biópsia cirúrgica de tecido
      nota: Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos sejam estéreis por autoclavagem ou uso de instrumentos descartáveis pré-esterilizados.
      1. Raspe o cabelo da parte inferior das costas de camundongos machos ou fêmeas NSG de 6 a 8 semanas, deixando uma área de aproximadamente 1,5 cm x 3 cm sem pelos. Anestesiar camundongos usando isoflurano e confirmar apertando suavemente o pé como um teste de capacidade de resposta. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento.
      2. Coloque os ratos individuais em uma almofada térmica no cone do nariz da máquina de anestesia, esfregue a área raspada com clorexidina. Em seguida, mergulhe com etanol 70% e deixe evaporar.
      3. Prepare pedaços ou divida a pasta tumoral em uma placa de Petri em montes individuais para implantação cirúrgica (ou seja, em três montes iguais, se for implantado em 3 camundongos).
      4. Usando a lâmina do bisturi, faça uma incisão de aproximadamente 5 mm de comprimento no centro das costas do mouse, pegue uma pinça e levante a pele do lado da incisão oposto ao operador.
      5. Pegue a tesoura na outra mão e separe a pele da camada muscular cortando suavemente a membrana fascial com pequenos cortes em tesoura, criando assim uma "bolsa" para o tecido tumoral.
      6. Pegue um pedaço de tumor ou um monte individual de tecido de pasta tumoral com a lâmina do bisturi e coloque suavemente o tecido na bolsa criada.
      7. Administre 100 μL de matriz extracelular artificial no monte de tecido tumoral na bolsa.
      8. Usando dois pares de pinças, puxe a incisão em ambas as extremidades para que as bordas da ferida se aproximem e feche a ferida aplicando um ou dois clipes de ferida.
      9. Injetar 1-5 mg/kg de meloxicam por via subcutânea como analgésico em ratinhos após a cirurgia.
      10. Retire o rato do cone do nariz e coloque-o de volta em sua gaiola original; observe o rato enquanto acorda. Não retorne a uma gaiola até que esteja totalmente recuperado.
      11. Remova os clipes da ferida após aproximadamente 7 dias. Se a cicatrização não estiver completa após 7 dias, deixe o clipe da ferida por mais um ou dois dias.
          nota: Se estiver usando uma suspensão de célula única de excisão cirúrgica ou processamento de tecido de biópsia cirúrgica, ela se misturará com matriz extracelular artificial (na proporção de 1:1) para injeção em camundongos.
   2. Injeção de PAAF ou tecido de biópsia central
      1. Coloque um mouse NSG em um rack de grade de aço, segure o mouse firmemente pela cauda e puxe suavemente o mouse para trás. Ele agarrará a grade com as patas dianteiras com firmeza. Alternativamente, prenda o mouse na mão não dominante e deixe a área do flanco visível.
      2. Desinfete a pele do flanco com cotonetes de preparação com álcool. Injete lenta e firmemente o conteúdo da seringa sob a pele do camundongo.
      3. Puxe a agulha e coloque o mouse de volta em sua gaiola.
3. Monitore o crescimento do tumor
   1. Monitore os camundongos uma vez por semana para verificar se há tumores palpáveis.
   2. Quando os tumores estiverem em um tamanho mensurável (aproximadamente 50 mm³), use um paquímetro para registrar as dimensões do tumor. Use a seguinte fórmula para calcular os volumes do tumor: (largura x largura x comprimento) / 2.
   3. Colha o tumor assim que o volume do tumor atingir cerca de 1,5 cm³ (aproximadamente 4-10 semanas). O tumor agora é chamado de passagem de camundongo 1 (MP1).

Figura 1: Métodos alternativos de implantação.(A) Os tumores podem ser processados em pedaços, uma suspensão de pasta ou como uma suspensão de célula única. (B) Todos os três métodos permitirão o crescimento de tumores in vivo. Aqui são mostrados camundongos implantados por via subcutânea com tumor e fotografados 12 dias após a implantação. (C) São mostradas as curvas de crescimento tumoral para os camundongos injetados com um dos três métodos de implantação. N = 5 por braço; As barras de erro são erros padrão.