Método de gota suspensa: uma técnica para gerar esferoides de melanoma 3D

Resumo

Fonte: Müller, I. et al., Um modelo de pele esferóide de melanoma organotípico 3D. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve a técnica de geração de esferoides tridimensionais por meio do método de gota suspensa usando células de melanoma. O modelo esferóide de melanoma organotípico tridimensional (3D) gerado in vitro pode retratar a arquitetura in vivo do melanoma maligno e pode fornecer informações sobre as interações intratumorais.

Protocolo

1. Geração de esferoides de melanoma 3D através do método de gota suspensa

1. Cultive células de melanoma (por exemplo, 451-LU ou qualquer linha celular de melanoma de interesse) de acordo com protocolos gerais, usando RPMI contendo 10% de FCS.
   1. Para gerar esferóides de melanoma de tamanho e qualidade semelhantes, lave as células de melanoma em PBS, adicione 5 mL de 1x tripsina-EDTA em PBS às células em um frasco de cultura de células T175 e incube por 3 a 5 min em temperatura ambiente (RT). Neutralize a tripsina adicionando 5 mL de RPMI / 10% FCS. Colha as células por centrifugação a 200 x g por 5 min. Ressuspenda o pellet celular em RPMI/FCS a uma concentração final de 10.000 células/mL, conforme determinado pela contagem em um hemocitômetro.
2. Colocar 40 x 25 μL (= 250 células) da suspensão celular na superfície interna da tampa de uma placa de cultura de células estéril não adesiva (Ø 10 cm) usando uma pipeta múltipla eletrônica. Com um movimento rápido, mas suave, gire a tampa e coloque-a na respectiva placa de cultura de células contendo 5 mL de PBS.
   1. Cultura de "travessas suspensas" em incubadora de células a 37 °C e 5% de CO₂ por 10-14 dias, dependendo do tipo de célula utilizada.
      nota: As células da fase de crescimento do melanoma metastático geralmente crescem mais rápido e formam esferoides mais sólidos na gota suspensa em comparação com as células de melanoma derivadas da fase de crescimento radial ou da fase de crescimento vertical. Para avaliação individual, observe o crescimento do esferóide sob um par de binóculos ou sob um microscópio óptico (ampliação de 4X). Normalmente, os esferoides tornam-se detectáveis após 48 h sob um par de binóculos ou sob um microscópio óptico (aumento de 4X). Após 10-14 dias, eles são visíveis sem qualquer dispositivo de ampliação.
3. Cinco dias após o avistamento inicial da gota, adicione 10 μL de meio RPMI fresco / 10% FCS a cada gota. Em seguida, troque 10 μL de meio em dias alternados. O uso de um dispensador eletrônico é muito útil nesta etapa.
4. Dependendo do tipo de célula, colha os esferóides após 10-15 dias. Enxágue cuidadosamente os esferóides da tampa da placa de cultura de células suspensa com PBS. Colete 10-20 esferóides em uma placa de cultura de células estéril e não adesiva. Remova cuidadosamente o excesso de PBS com uma pipeta Pasteur.
   nota: O período de cultivo depende da fase de crescimento do tumor das células de melanoma quando foram inicialmente derivadas, por exemplo, esferóides derivados de células 451-LU crescem até aproximadamente 500 μm de diâmetro dentro de 12 dias após o cultivo na gota suspensa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
albumina sérica fetal (FCS)	Thermo Fisher Científico	10270106	Adicionar 10 % ao meio de cultura celular
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Científico	25300054	1X diluído em PBS
RPMI	Thermo Fisher Científico	61870010	Para cultivo de linhagens celulares de melanoma