Geração de reconstruções organotípicas de pele completa: um procedimento para estabelecer um modelo de pele 3D usando amostras de pele humana

Resumo

Fonte: Müller, I. et al. Um modelo de pele esferóide de melanoma organotípico 3D. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve o protocolo detalhado para gerar reconstruções organotípicas da pele in vitro em 3D para estudar a progressão do melanoma. Este modelo de pele imita a arquitetura e a complexidade multicelular dos órgãos in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Isolamento de queratinócitos primários da epiderme

1. Lave o tecido epidérmico com PBS. Corte a epiderme em pedaços menores (1 mm²) e colete-os em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 10 mL 1x Tripsina-EDTA (pré-aquecido a 37 °C) e incube por 5 min em banho-maria a 37 °C. Vortex a suspensão de tecido a cada 2 min.
2. Pare a reação enzimática adicionando 1 mL de so....

Resultados

Figura 1: Cultivo de reconstruções de pele organotípica 3D submersas com meio e na interface ar-líquido. No dia 0, os queratinócitos primários são semeados no topo do compartimento dérmico que consiste em fibroblastos primários embutidos em uma matriz de colágeno tipo I. As reconstruções de pele 3D permanecem cultivadas submersas com EGM por 7 dias, desprendem-se da parede de inserção e começam a enc.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
albumina sérica fetal (FCS)	Thermo Fisher Científico	10270106	adicionar 10 % ao meio de cultura celular
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Científico	25300054	1X diluído em PBS
DMEM	Thermo Fisher Científico	41965062	para cultivo de fibroblastos primários
Exibir	Tecnologias de vida Gibco	17105041	2U/ml, dissolver em PBS
Colágeno tipo I	BD Biociências	354249	geralmente da cauda de rato, a concentração deve ser de 3,5-4 mg / ml
Insertos de 24 poços Nunclon	Nunc	140629	Tamanho de poro de 8 μm; use inserções em pé, não suspensas
filtro de células	Falcão BD	Rolamento 352360	amarelo
Gentamicina	Thermo Fisher Científico	15750060	dissolver em PBS
Meio de queratincita Keralife	Sistemas Celulares		não adicione FCS ou antibióticos
Colagenase	SERVA	Rolamento 17454	Classe padrão NB4
queratinócitos humanos juvenis	Sistemas Celulares	FC-0007	alternativa à própria preparação a partir de prepúcio juvenil
Fibroblastos humanos juvenis	Sistemas Celulares	FC-0001	alternativa à própria preparação a partir de prepúcio juvenil
FEG	Tecnologias de vida Gibco	13247-051	adicionar 10 ng/ml apenas para a geração do meio EGM
Cloreto de cálcio	Produtos Químicos Merck	2381	adicionar 1,9 mM para a geração de EGM e 3,8 mM para o meio MM
Ácido selênico	Alfa Aesar	Rolamento 18851	adicionar 53 nM para a geração de EGM e MM médio
insulina	Lilly	HI0219 Caneta de Zumbido 3ml 100 E.I./ml	adicionar 5 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
etanolamina	Sigma-Aldrich	E-0135	adicionar 0,1 mM para a geração de EGM e MM médio
P-etanolamina	Sigma-Aldrich	Pág. P-0503	adicionar 0,1 mM para a geração de EGM e MM médio
Holo-Transferrina	Sigma-Aldrich	T-0665	adicionar 5 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
triiodotironina	Sigma-Aldrich	T-6397	adicionar 20 pM para a geração de EGM e MM médio
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H-088816	adicionar 0,4 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
progesterona	Sigma-Aldrich	Pág. 8783	adicionar 10 nM apenas para a geração de meio EGM
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	adicionar 15 mM para a geração de EGM e MM médio
serina	Sigma-Aldrich	S-4311	adicionar 1 mM para a geração de EGM e MM médio
Cloreto de colina	Sigma-Aldrich	C-7017	adicionar 0,64 mM para a geração de EGM e MM médio
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lote 086K0361	adicionar 2 % para a geração de EGM e MM
adenina	Sigma-Aldrich	A-9795	adicionar 0,18 mM para a geração de EGM e MM médio
L-Glutamina	PromoCell	C-42209	adicionar 7,25 mM para a geração de EGM e MM médio
Cloreto de estrôncio	Sigma-Aldrich	255521	adicionar 1 mM para a geração de EGM e MM médio