Geração de reconstruções organotípicas de pele completa: um procedimento para estabelecer um modelo de pele 3D usando amostras de pele humana

Resumo

Fonte: Müller, I. et al. Um modelo de pele esferóide de melanoma organotípico 3D. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve o protocolo detalhado para gerar reconstruções organotípicas da pele in vitro em 3D para estudar a progressão do melanoma. Este modelo de pele imita a arquitetura e a complexidade multicelular dos órgãos in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Isolamento de queratinócitos primários da epiderme

1. Lave o tecido epidérmico com PBS. Corte a epiderme em pedaços menores (1 mm²) e colete-os em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 10 mL 1x Tripsina-EDTA (pré-aquecido a 37 °C) e incube por 5 min em banho-maria a 37 °C. Vortex a suspensão de tecido a cada 2 min.
2. Pare a reação enzimática adicionando 1 mL de soro fetal de bezerro (FCS). Ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de plástico de 10 mL por 4 min. Tente evitar bolhas e formação de espuma.
3. Pipetar a suspensão celular em um filtro de célula (tamanho de poro 100 μm), colocado em cima de um tubo cônico fresco de 50 mL e enxaguar 3x com 5 mL de PBS. Centrifugue as células a 200 x g por 5 min. Ressuspenda o pellet celular em 2-6 mL de meio de cultura contendo 1% (v / v) de gentamicina. Determine o número de células manualmente contando as células em um hemocitômetro e semeie 6 x 10⁵ células em um frasco de cultura de células T75.

2. Isolamento de fibroblastos primários da derme

1. Corte o tecido dérmico em pedaços menores (1 mm²) e transfira-os para um tubo cônico de 50 mL. Adicionar 10 ml de solução de colagenase (5 U/ml em PBS⁺) e incubar durante 45 min em banho-maria a 37 °C. Centrifugar a mistura de pedaços de tecido e células a 200 x g durante 5 min.
2. Lave o pellet celular duas vezes com 10 mL de DMEM contendo 4,5 g / L de glicose e L-glutamina, mas sem L-piruvato. Finalmente, ressuspenda os pedaços de tecido em 2 mL de DMEM contendo 1% (v / v) de gentamicina e 10% de FCS. Transfira-os para um frasco de cultura de células T25 e incube em uma incubadora de células a 37 °C e 5% de CO₂ durante a noite.
   NOTA: O pequeno volume permite que os fibroblastos migrem para fora dos detritos do tecido e os força a se fixarem no frasco de cultura.
3. Na manhã seguinte, adicione mais 6 mL de DMEM/Gentamicina/FCS e incube por 2-3 dias a 37 °C até que as células atinjam 80-90% de confluência.

3. Geração do Compartimento Dérmico de Reconstruções Organotípicas de Pele Completa

1. Gere modelos de pele usando inserções de membrana microporosa de células de 24 poços (tamanho de poro de 8 μm) colocadas em placas de 24 poços.
   nota: Certifique-se de não usar inserções suspensas, mas em pé, porque elas serão colocadas em uma placa de 6 poços para cultivo de ar-líquido em um estágio posterior.
2. Prepare a solução de neutralização em gel (GNL), bem como os meios de cultura referidos como MM e meios de crescimento endotelial (EGM). Para evitar a coagulação, armazene o colágeno tipo I (geralmente da cauda de rato, 3,5-4 mg / mL em ácido acético 0,02 N) no gelo até o uso, pois ele começa a gelificar no RT.
3. Ressuspenda 1 x 10⁵ fibroblastos por inserção em GNL e misture rapidamente a suspensão celular com colágeno na proporção de 1:3 em um volume final de 500 μL/inserção. Misture pipetando suavemente para cima e para baixo para evitar a formação de bolhas, pois as bolhas podem prejudicar a qualidade da reconstrução da pele.
4. Deixe os géis dérmicos individuais assentarem, mantendo-os sem meio em RT por 30 min em um capuz estéril. Em seguida, cubra cada gel com DMEM contendo 4,5 g / L de glicose, 1% de L-glutamina, 10% de FCS e sem L-piruvato e incube durante a noite a 37 ° C.

4. Geração do Compartimento Epidérmico de Reconstruções Organotípicas de Pele Completa

1. No dia seguinte, retire o meio dos géis dérmicos e equilibre-os com meio EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL de gentamicina) por 2 h a 37 °C. Retire o meio e semeie cuidadosamente 1 x 10⁵ queratinócitos ressuspensos em 100 μL de EGM sobre o gel dérmico.
2. Incubar as reconstruções por 1,5 h a 37 °C para permitir que os queratinócitos adiram ao compartimento dérmico.
   nota: Durante esse tempo de incubação, os géis começarão a encolher devido à contração induzida por fibroblastos e, portanto, pelo menos se desprendem parcialmente das paredes da inserção.
3. Cubra os equivalentes de pele com aproximadamente 800 μL de EGM e remova cuidadosamente o gel residual da parede de inserção com uma pequena ponta de pipeta (branca). Cultivar os equivalentes cutâneos submersos em EGM por 7 dias em incubadora de células a 37 °C, 5% de CO₂ e trocar o meio em dias alternados.
   nota: Durante esse período, os equivalentes de pele encolherão significativamente.

5. Cultivo ar-líquido de reconstruções organotípicas de pele completa

1. No dia 8, transfira cada inserto para um poço individual de uma placa de 6 poços. Adicione apenas 1,2-1,4 mL de meio MM a cada poço, de modo que a reconstrução da pele seja fornecida com meio do fundo do poço, mas não seja coberta com o meio.
   nota: O cultivo na interface ar-líquido permite a estratificação da parte epidérmica e o estabelecimento de uma camada cornificada completa (estrato córneo).
2. Durante os próximos 10-17 dias, mude o meio conforme indicado na seção 5.1 a cada dois dias. Durante este período, adicione drogas ou outros estímulos conforme necessário ao meio. Remova cuidadosamente a reconstrução de pele completa da inserção da membrana microporosa usando uma pinça curva para análise posterior, por exemplo, análise imuno-histoquímica (Figura 1).

Resultados

Figura 1: Cultivo de reconstruções de pele organotípica 3D submersas com meio e na interface ar-líquido. No dia 0, os queratinócitos primários são semeados no topo do compartimento dérmico que consiste em fibroblastos primários embutidos em uma matriz de colágeno tipo I. As reconstruções de pele 3D permanecem cultivadas submersas com EGM por 7 dias, desprendem-se da parede de inserção e começam a enc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
albumina sérica fetal (FCS)	Thermo Fisher Científico	10270106	adicionar 10 % ao meio de cultura celular
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Científico	25300054	1X diluído em PBS
DMEM	Thermo Fisher Científico	41965062	para cultivo de fibroblastos primários
Exibir	Tecnologias de vida Gibco	17105041	2U/ml, dissolver em PBS
Colágeno tipo I	BD Biociências	354249	geralmente da cauda de rato, a concentração deve ser de 3,5-4 mg / ml
Insertos de 24 poços Nunclon	Nunc	140629	Tamanho de poro de 8 μm; use inserções em pé, não suspensas
filtro de células	Falcão BD	Rolamento 352360	amarelo
Gentamicina	Thermo Fisher Científico	15750060	dissolver em PBS
Meio de queratincita Keralife	Sistemas Celulares		não adicione FCS ou antibióticos
Colagenase	SERVA	Rolamento 17454	Classe padrão NB4
queratinócitos humanos juvenis	Sistemas Celulares	FC-0007	alternativa à própria preparação a partir de prepúcio juvenil
Fibroblastos humanos juvenis	Sistemas Celulares	FC-0001	alternativa à própria preparação a partir de prepúcio juvenil
FEG	Tecnologias de vida Gibco	13247-051	adicionar 10 ng/ml apenas para a geração do meio EGM
Cloreto de cálcio	Produtos Químicos Merck	2381	adicionar 1,9 mM para a geração de EGM e 3,8 mM para o meio MM
Ácido selênico	Alfa Aesar	Rolamento 18851	adicionar 53 nM para a geração de EGM e MM médio
insulina	Lilly	HI0219 Caneta de Zumbido 3ml 100 E.I./ml	adicionar 5 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
etanolamina	Sigma-Aldrich	E-0135	adicionar 0,1 mM para a geração de EGM e MM médio
P-etanolamina	Sigma-Aldrich	Pág. P-0503	adicionar 0,1 mM para a geração de EGM e MM médio
Holo-Transferrina	Sigma-Aldrich	T-0665	adicionar 5 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
triiodotironina	Sigma-Aldrich	T-6397	adicionar 20 pM para a geração de EGM e MM médio
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H-088816	adicionar 0,4 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
progesterona	Sigma-Aldrich	Pág. 8783	adicionar 10 nM apenas para a geração de meio EGM
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	adicionar 15 mM para a geração de EGM e MM médio
serina	Sigma-Aldrich	S-4311	adicionar 1 mM para a geração de EGM e MM médio
Cloreto de colina	Sigma-Aldrich	C-7017	adicionar 0,64 mM para a geração de EGM e MM médio
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lote 086K0361	adicionar 2 % para a geração de EGM e MM
adenina	Sigma-Aldrich	A-9795	adicionar 0,18 mM para a geração de EGM e MM médio
L-Glutamina	PromoCell	C-42209	adicionar 7,25 mM para a geração de EGM e MM médio
Cloreto de estrôncio	Sigma-Aldrich	255521	adicionar 1 mM para a geração de EGM e MM médio