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Geração de reconstruções organotípicas de pele completa: um procedimento para estabelecer um modelo de pele 3D usando amostras de pele humana

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30 de abril de 2023

Neste artigo

Resumo

Fonte: Müller, I. et al. Um modelo de pele esferóide de melanoma organotípico 3D. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve o protocolo detalhado para gerar reconstruções organotípicas da pele in vitro em 3D para estudar a progressão do melanoma. Este modelo de pele imita a arquitetura e a complexidade multicelular dos órgãos in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Isolamento de queratinócitos primários da epiderme

  1. Lave o tecido epidérmico com PBS. Corte a epiderme em pedaços menores (1 mm2) e colete-os em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 10 mL 1x Tripsina-EDTA (pré-aquecido a 37 °C) e incube por 5 min em banho-maria a 37 °C. Vortex a suspensão de tecido a cada 2 min.
  2. Pare a reação enzimática adicionando 1 mL de so....

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Resultados

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Figura 1: Cultivo de reconstruções de pele organotípica 3D submersas com meio e na interface ar-líquido. No dia 0, os queratinócitos primários são semeados no topo do compartimento dérmico que consiste em fibroblastos primários embutidos em uma matriz de colágeno tipo I. As reconstruções de pele 3D permanecem cultivadas submersas com EGM por 7 dias, desprendem-se da parede de inserção e começam a enc.......

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
albumina sérica fetal (FCS)Thermo Fisher Científico10270106adicionar 10 % ao meio de cultura celular
Tripsina-EDTAThermo Fisher Científico253000541X diluído em PBS
DMEMThermo Fisher Científico41965062para cultivo de fibroblastos primários
ExibirTecnologias de vida Gibco171050412U/ml, dissolver em PBS
Colágeno tipo IBD Biociências354249geralmente da cauda de rato, a concentração deve ser de 3,5-4 mg / ml
Insertos de 24 poços NunclonNunc140629Tamanho de poro de 8 μm; use inserções em pé, não suspensas
filtro de célulasFalcão BDRolamento 352360amarelo
GentamicinaThermo Fisher Científico15750060dissolver em PBS
Meio de queratincita KeralifeSistemas Celularesnão adicione FCS ou antibióticos
ColagenaseSERVARolamento 17454Classe padrão NB4
queratinócitos humanos juvenisSistemas CelularesFC-0007alternativa à própria preparação a partir de prepúcio juvenil
Fibroblastos humanos juvenisSistemas CelularesFC-0001alternativa à própria preparação a partir de prepúcio juvenil
FEGTecnologias de vida Gibco13247-051adicionar 10 ng/ml apenas para a geração do meio EGM
Cloreto de cálcioProdutos Químicos Merck2381adicionar 1,9 mM para a geração de EGM e 3,8 mM para o meio MM
Ácido selênicoAlfa AesarRolamento 18851adicionar 53 nM para a geração de EGM e MM médio
insulinaLillyHI0219 Caneta de Zumbido 3ml 100 E.I./mladicionar 5 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
etanolaminaSigma-AldrichE-0135adicionar 0,1 mM para a geração de EGM e MM médio
P-etanolaminaSigma-AldrichPág. P-0503adicionar 0,1 mM para a geração de EGM e MM médio
Holo-TransferrinaSigma-AldrichT-0665adicionar 5 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
triiodotironinaSigma-AldrichT-6397adicionar 20 pM para a geração de EGM e MM médio
HidrocortisonaSigma-AldrichH-088816adicionar 0,4 μg/ml para a geração de EGM e meio MM
progesteronaSigma-AldrichPág. 8783adicionar 10 nM apenas para a geração de meio EGM
HepesSigma-AldrichH-3784adicionar 15 mM para a geração de EGM e MM médio
serinaSigma-AldrichS-4311adicionar 1 mM para a geração de EGM e MM médio
Cloreto de colinaSigma-AldrichC-7017adicionar 0,64 mM para a geração de EGM e MM médio
dFCSSigma-AldrichF-0392 Lote 086K0361adicionar 2 % para a geração de EGM e MM
adeninaSigma-AldrichA-9795adicionar 0,18 mM para a geração de EGM e MM médio
L-GlutaminaPromoCellC-42209adicionar 7,25 mM para a geração de EGM e MM médio
Cloreto de estrôncioSigma-Aldrich255521adicionar 1 mM para a geração de EGM e MM médio

Reimpressões e permissões

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Etiquetas

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