Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Isolamento de queratinócitos primários da epiderme
- Lave o tecido epidérmico com PBS. Corte a epiderme em pedaços menores (1 mm2) e colete-os em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 10 mL 1x Tripsina-EDTA (pré-aquecido a 37 °C) e incube por 5 min em banho-maria a 37 °C. Vortex a suspensão de tecido a cada 2 min.
- Pare a reação enzimática adicionando 1 mL de soro fetal de bezerro (FCS). Ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de plástico de 10 mL por 4 min. Tente evitar bolhas e formação de espuma.
- Pipetar a suspensão celular em um filtro de célula (tamanho de poro 100 μm), colocado em cima de um tubo cônico fresco de 50 mL e enxaguar 3x com 5 mL de PBS. Centrifugue as células a 200 x g por 5 min. Ressuspenda o pellet celular em 2-6 mL de meio de cultura contendo 1% (v / v) de gentamicina. Determine o número de células manualmente contando as células em um hemocitômetro e semeie 6 x 105 células em um frasco de cultura de células T75.
2. Isolamento de fibroblastos primários da derme
- Corte o tecido dérmico em pedaços menores (1 mm2) e transfira-os para um tubo cônico de 50 mL. Adicionar 10 ml de solução de colagenase (5 U/ml em PBS+) e incubar durante 45 min em banho-maria a 37 °C. Centrifugar a mistura de pedaços de tecido e células a 200 x g durante 5 min.
- Lave o pellet celular duas vezes com 10 mL de DMEM contendo 4,5 g / L de glicose e L-glutamina, mas sem L-piruvato. Finalmente, ressuspenda os pedaços de tecido em 2 mL de DMEM contendo 1% (v / v) de gentamicina e 10% de FCS. Transfira-os para um frasco de cultura de células T25 e incube em uma incubadora de células a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.
NOTA: O pequeno volume permite que os fibroblastos migrem para fora dos detritos do tecido e os força a se fixarem no frasco de cultura.
- Na manhã seguinte, adicione mais 6 mL de DMEM/Gentamicina/FCS e incube por 2-3 dias a 37 °C até que as células atinjam 80-90% de confluência.
3. Geração do Compartimento Dérmico de Reconstruções Organotípicas de Pele Completa
- Gere modelos de pele usando inserções de membrana microporosa de células de 24 poços (tamanho de poro de 8 μm) colocadas em placas de 24 poços.
nota: Certifique-se de não usar inserções suspensas, mas em pé, porque elas serão colocadas em uma placa de 6 poços para cultivo de ar-líquido em um estágio posterior.
- Prepare a solução de neutralização em gel (GNL), bem como os meios de cultura referidos como MM e meios de crescimento endotelial (EGM). Para evitar a coagulação, armazene o colágeno tipo I (geralmente da cauda de rato, 3,5-4 mg / mL em ácido acético 0,02 N) no gelo até o uso, pois ele começa a gelificar no RT.
- Ressuspenda 1 x 105 fibroblastos por inserção em GNL e misture rapidamente a suspensão celular com colágeno na proporção de 1:3 em um volume final de 500 μL/inserção. Misture pipetando suavemente para cima e para baixo para evitar a formação de bolhas, pois as bolhas podem prejudicar a qualidade da reconstrução da pele.
- Deixe os géis dérmicos individuais assentarem, mantendo-os sem meio em RT por 30 min em um capuz estéril. Em seguida, cubra cada gel com DMEM contendo 4,5 g / L de glicose, 1% de L-glutamina, 10% de FCS e sem L-piruvato e incube durante a noite a 37 ° C.
4. Geração do Compartimento Epidérmico de Reconstruções Organotípicas de Pele Completa
- No dia seguinte, retire o meio dos géis dérmicos e equilibre-os com meio EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL de gentamicina) por 2 h a 37 °C. Retire o meio e semeie cuidadosamente 1 x 105 queratinócitos ressuspensos em 100 μL de EGM sobre o gel dérmico.
- Incubar as reconstruções por 1,5 h a 37 °C para permitir que os queratinócitos adiram ao compartimento dérmico.
nota: Durante esse tempo de incubação, os géis começarão a encolher devido à contração induzida por fibroblastos e, portanto, pelo menos se desprendem parcialmente das paredes da inserção.
- Cubra os equivalentes de pele com aproximadamente 800 μL de EGM e remova cuidadosamente o gel residual da parede de inserção com uma pequena ponta de pipeta (branca). Cultivar os equivalentes cutâneos submersos em EGM por 7 dias em incubadora de células a 37 °C, 5% de CO2 e trocar o meio em dias alternados.
nota: Durante esse período, os equivalentes de pele encolherão significativamente.
5. Cultivo ar-líquido de reconstruções organotípicas de pele completa
- No dia 8, transfira cada inserto para um poço individual de uma placa de 6 poços. Adicione apenas 1,2-1,4 mL de meio MM a cada poço, de modo que a reconstrução da pele seja fornecida com meio do fundo do poço, mas não seja coberta com o meio.
nota: O cultivo na interface ar-líquido permite a estratificação da parte epidérmica e o estabelecimento de uma camada cornificada completa (estrato córneo).
- Durante os próximos 10-17 dias, mude o meio conforme indicado na seção 5.1 a cada dois dias. Durante este período, adicione drogas ou outros estímulos conforme necessário ao meio. Remova cuidadosamente a reconstrução de pele completa da inserção da membrana microporosa usando uma pinça curva para análise posterior, por exemplo, análise imuno-histoquímica (Figura 1).