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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de células B16-BL6
- Remova as placas de cultura de células da incubadora de 37 graus e coloque-as em uma capa estéril. As placas devem ser aproximadamente 70% confluentes com células de melanoma murino B16-BL6. Uma maior confluência pode alterar o potencial metastático das células.
- Adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% por placa, deixe descansar por 1 min e, em seguida, aspire a solução de tripsina média.
- Adicione 1 mL de tripsina por placa e retorne as placas à incubadora por 10 min.
- Depois de mover as placas da incubadora para a coifa estéril, adicione 4 mL de meio Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) sem soro a cada placa.
- Colete as células com uma pipeta motorizada estéril. Ejete as células contra o fundo da placa, com a ponta pressionada em um ângulo muito leve, para quebrar as células. Repita várias vezes para garantir a separação adequada dos aglomerados de células, que de outra forma poderiam entupir a agulha de ejeção. Recolher e transferir para um tubo cónico de 50 ml.
- Use um hemocitômetro para determinar a densidade celular. Mantendo constante o número total de células B16-BL6, determine o volume de RPMI livre de soro necessário para atingir concentrações finais de 0, 0,065, 0,015, 0,25 e 0,5 milhão de células/mL.
- Igualmente alíquota do meio no tubo de 50 mL para tubos cônicos de 15 mL. Centrifugue os tubos cônicos a 2.250 x g por 5 min. Decantar a mídia. Adicione um volume apropriado de RPMI sem soro e confirme a densidade celular desejada via hemocitômetro. Ajuste as densidades adicionando RPMI adicional ou girando e ressuspendendo em um volume menor de acordo.
- Alíquota de 500 μL de cada suspensão celular em tubos marcados de 1,8 mL no gelo.
2. Injeção na veia da cauda
- Compre camundongos C57BL/6 fêmeas (idade de 6 a 8 semanas), 5 camundongos por grupo. Aguarde vários dias para que os ratos se ajustem.
- Pegue um mouse, segurado pela cauda, e guie-o para trás no limitador de mouse. Com o tronco na câmara principal do limitador e a cauda para fora dele, puxe o mouse em direção ao final do limitador. Insira o êmbolo do retentor, continuando a empurrar até que o mouse esteja seguro.
- Gire o mouse 90 graus de modo que uma das veias laterais da cauda fique voltada para cima. Usando uma compressa com álcool, limpe vigorosamente a lateral da cauda do rato, principalmente onde a veia da cauda é mais visível.
nota: Uma boa iluminação é essencial para a visualização eficaz da veia da cauda em camundongos B57BL / 6J. Lâmpadas de calor ou almofadas cirúrgicas aquecidas, embora não sejam necessárias, também ajudam a aumentar o volume da veia da cauda.
- Em uma capela de cultura estéril, colete 300 μL de meio de cultura de células do tubo de 2 milhões de células/mL. Inverta a agulha, sacudindo o lado e empurrando o êmbolo, para ejetar as bolhas da seringa. Ejetar cultura RPMI para resultar em um volume final de 250 μL.
- Estenda a cauda do rato com a mão não dominante. Segure a cauda com a extremidade proximal da cauda elevada com o indicador da mão não dominante e a porção distal da cauda pressionada com o polegar.
nota: Desta forma, a veia da cauda é mantida em posição lateral, paralela à superfície de contenção, com uma entrada congruente possível na parte mais distal da cauda.
- Insira a agulha na veia da cauda, em direção à extremidade distal, em um ângulo minúsculo para baixo para começar e, em seguida, ajuste a agulha para corresponder ao ângulo da veia da cauda após a inserção posterior (abaixando a extremidade do êmbolo da seringa em relação à agulha).
- Insira a agulha aproximadamente 1 cm na veia da cauda. Após a inserção, comece a empurrar o êmbolo, segurando a agulha com firmeza.
nota: Se a agulha estiver na veia da cauda e a extremidade da agulha não estiver obstruída, o meio deve fluir desimpedido para dentro da veia. Uma injeção eficaz é caracterizada pela depuração do sangue da veia. Se houver resistência ou se uma bolha começar a se formar no local da injeção, remova a agulha e tente novamente em um local mais proximal ao longo da veia da cauda.
- Remova a agulha da veia e descarte-a. Segure a gaze contra o local de entrada para parar qualquer sangramento.
- Remova o êmbolo do limitador e coloque o mouse na gaiola receptora.
- Repita para todas as outras concentrações.
nota: O estabelecimento de focos pulmonares leva aproximadamente 2-3 semanas, com variabilidade dependendo da linhagem celular e do tamanho desejado dos focos. Nesse ínterim, os camundongos devem ser monitorados quanto a sintomas que possam justificar a eutanásia precoce, como respiração ofegante excessiva.
3. Contando os focos pulmonares
- Eutanasiar o camundongo colocando-o em uma câmara de CO2 e expondo-o a 100% de CO2 introduzido a 10-30% do volume da câmara por minuto por 5 min. Em seguida, com luxação cervical.
- Espalhe o mouse no isopor. Usando uma tesoura cirúrgica, crie uma incisão cirúrgica ao longo do esterno.
- Faça duas incisões adicionais, ambas a partir do topo da incisão do esterno e ramificando-se em direção aos ombros do camundongo, expondo a caixa torácica.
- Faça dois cortes, cada um ao longo dos lados laterais do esterno, para remover a caixa torácica do tronco, expondo os pulmões e o coração.
- Segurando o coração com uma pinça cirúrgica, corte o esôfago e a traqueia, liberando o coração e os pulmões do camundongo. Coloque sob um microscópio de dissecação, com ampliação de 10X, para melhor visualização.
- Disseque o coração dos pulmões e remova o timo, deixando apenas os dois pulmões.
- Com os pulmões abaixo de um escopo de dissecação, comece a contar os focos pulmonares. Cada foco deve aparecer como uma intrusão circular e marrom na superfície dos pulmões.
- Para consistência entre os camundongos, conte o número de focos na superfície de um lóbulo e, em seguida, inverta esse lóbulo. Fazer cada um dos quatro lóbulos individualmente permite uma contagem mais fácil.
- Salve e conserte os pulmões se estiver realizando IHC, caso contrário, descarte os restos.