HCR-DNA FISH: Uma técnica de hibridização in situ de fluorescência para detectar DNA viral em células infectadas

Resumo

Fonte: Wei Liu et al., Infecção e Detecção de Poliomavírus de Células Merkel, J. Vis. Exp. (2019).

Neste vídeo, as células infectadas com vírions MCPyV foram submetidas a uma reação em cadeia de hibridização in situ para detectar genomas específicos do MCPyV. Além disso, a técnica DNA-HCR foi combinada com FISH para visualizar o DNA MCPyV em células da pele humana infectadas.

Protocolo

1. Infecção

1. Manter fibroblastos dérmicos humanos primários em DMEM com 10% de soro fetal de bezerro, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de L-glutamina. Ao atingir a confluência, dividir os fibroblastos 1:4 sem girar.
   nota: Para obter a maior eficiência de infecção por MCPyV, use fibroblastos primários entre as passagens 5 e 12 que estão se dividindo ativamente no momento do plaqueamento.
2. Para infectar fibroblastos dérmicos humanos, aspire o meio e lave as células com DPBS.
3. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% ao prato e incube a 37 °C por 5-10 min.
4. Verifique ao microscópio se as cé....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Buffer de hibridização de sonda	Tecnologias moleculares
Tampão de lavagem da sonda	Tecnologias moleculares
Buffer de amplificação	Tecnologias moleculares
grampos de cabelo rotulados com Alexa 594	Tecnologias moleculares	B4	Proteger da luz
Paraformaldeído	Sigma	P6148