HCR-DNA FISH: Uma técnica de hibridização in situ de fluorescência para detectar DNA viral em células infectadas

Resumo

Fonte: Wei Liu et al., Infecção e Detecção de Poliomavírus de Células Merkel, J. Vis. Exp. (2019).

Neste vídeo, as células infectadas com vírions MCPyV foram submetidas a uma reação em cadeia de hibridização in situ para detectar genomas específicos do MCPyV. Além disso, a técnica DNA-HCR foi combinada com FISH para visualizar o DNA MCPyV em células da pele humana infectadas.

Protocolo

1. Infecção

1. Manter fibroblastos dérmicos humanos primários em DMEM com 10% de soro fetal de bezerro, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de L-glutamina. Ao atingir a confluência, dividir os fibroblastos 1:4 sem girar.
   nota: Para obter a maior eficiência de infecção por MCPyV, use fibroblastos primários entre as passagens 5 e 12 que estão se dividindo ativamente no momento do plaqueamento.
2. Para infectar fibroblastos dérmicos humanos, aspire o meio e lave as células com DPBS.
3. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% ao prato e incube a 37 °C por 5-10 min.
4. Verifique ao microscópio se as células estão saindo do prato.
5. Adicione 10 mL de meio DMEM/F12 contendo 20 ng/mL de EGF, 20 ng/mL de bFGF e 3 μM de CHIR99021, todos os quais estimulam a infecção por MCPyV, ao prato e transfira a solução celular para um tubo de 15 mL.
6. Gire as células a 180 x g por 2 min e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em meio DMEM / F12 contendo 20 ng / mL EGF, 20 ng / mL bFGF e 3μM CHIR99021 a 2-4 x 10⁴ células por mL.
7. Semear 200 μL da suspensão celular suplementada com 1 mg/mL de colagenase tipo IV em cada poço de uma placa de 96 poços. Descongele o caldo de vírion MCPyV no gelo. Adicione 10⁹ equivalentes do genoma viral de vírions MCPyV por 1 μL de iodixanol para cada 2.500 a 5.000 células a serem infectadas. Bata suavemente na lateral da placa e coloque a placa na incubadora.
8. Após incubação a 37 °C em 5% de CO₂ por 48-72 h, adicione 20% de FBS a cada poço.
9. Permitir que a infecção prossiga a 37 °C em 5% de CO₂ por 72-96 h.

2. DNA-HCR in situ

1. Fixe as células cultivadas em lamínulas com PFA a 4% em PBS por 10 min. Lave as lamínulas duas vezes com PBS e, em seguida, trate-as com etanol a 70% para permeabilizar as células a 4 °C durante a noite.
   nota: As amostras fixas podem permanecer nesse estado por vários dias.
2. Pré-hibridizar as amostras substituindo o etanol por tampão de hibridização da sonda e incubando por 60 min em RT.
3. Diluir a(s) sonda(s) (1 μM) (quadro 1) em solução tampão de hibridização da sonda a uma diluição de 1:500 30 min antes do final da fase de pré-hibridização e incubar a 45 °C.
4. No final das incubações, pipetar ~ 10 μL da mistura de sonda diluída por lamínula nas lâminas do microscópio. Coloque as lamínulas, com o lado da célula voltado para baixo, em suas respectivas gotículas da mistura da sonda de hibridização. Sele as bordas e as costas das lamínulas nas lâminas com uma quantidade generosa de cimento de borracha.
5. Aqueça as lâminas com sondas adicionadas a 94 °C por 3 minutos, colocando-as no lado plano de um bloco de calor. Transfira as lâminas para uma câmara umidificada e incube a 45 °C durante a noite. Para fazer uma câmara umidificada simples, umedeça levemente as toalhas de papel estéreis com dH₂O e coloque-as no fundo de um recipiente de plástico que sela com uma junta de borracha.
   nota: Durante o aquecimento, o cimento de borracha pode borbulhar brevemente. No entanto, certifique-se de que o selo não se rompa.
6. Retire cuidadosamente o cimento de borracha com uma pinça e coloque as lamínulas com o lado da célula de volta para cima em poços de uma placa de 24 poços. Lave as lamínulas com tampão de lavagem da sonda em RT três vezes.
7. Incubar a lamínula no tampão de amplificação (200 μL em placas de 24 poços) em RT por 30-60 min.
8. Enquanto isso, recoza cada um dos dois grampos de cabelo de oligonucleotídeos marcados, reconhecendo as sondas (Tabela 1) em tubos de PCR separados, aquecendo a 94 ° C por 90 s e resfriando a RT por 30 minutos, protegendo da luz. Misture os dois grampos de cabelo em tampão de amplificação, cada um em uma diluição de 1:50.
9. Faça uma superfície para a reação de amplificação esticando o filme de parafina sobre a face aberta de uma tampa de placa de 24 poços. Pipetar gotículas de 50-100 μL da mistura grampo de cabelo/tampão de amplificação para a película de parafina para cada lamínula. Use uma pinça para remover cuidadosamente as lamínulas da solução de pré-amplificação. Seque a lamínula tocando a borda em um lenço descartável poroso e coloque o lado da célula voltado para baixo na gota de amplificação.
10. Coloque a tampa da placa que contém as lamínulas em uma câmara umidificada e incube durante a noite em RT no escuro.
11. Devolva as lamínulas aos poços mais uma vez. Incubar as amostras com 5x SSCT [5x cloreto de sódio citrato de sódio (SSC) 0,1% Tween 20 filtrado através de um filtro de 0,22 μm] contendo 0,5 μg/mL DAPI por 1 h em RT. Lave as amostras duas vezes com 5x SSCT em RT.
12. Monte as lamínulas nas lâminas do microscópio. Analise as células e obtenha imagens das amostras usando um microscópio de fluorescência invertida.

Sonda MCPyV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
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Sonda MCPyV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 6	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 7	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatccccccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 8	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 9	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda de HPV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda de HPV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda de HPV 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcaatgcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda de HPV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcgggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda de HPV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabela 1: Sondas utilizadas no estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Buffer de hibridização de sonda	Tecnologias moleculares
Tampão de lavagem da sonda	Tecnologias moleculares
Buffer de amplificação	Tecnologias moleculares
grampos de cabelo rotulados com Alexa 594	Tecnologias moleculares	B4	Proteger da luz
Paraformaldeído	Sigma	P6148