Isolamento de queratinócitos da pele humana: um método para cultivar queratinócitos primários de amostras de pele

Resumo

Johansen, C. et al. Geração e Cultura de Queratinócitos Humanos Primários da Pele Adulta. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo descreve o isolamento de queratinócitos - as células mais proeminentes da camada epidérmica da pele humana, empregando uma combinação de digestão enzimática e métodos de ruptura mecânica. Este método ajuda no crescimento preferencial de queratinócitos em relação a outros tipos de células da pele usando um meio de crescimento seletivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Isolamento de queratinócitos da pele humana

1. Comece fazendo as seguintes soluções: 50 mL de solução de tripsina a 0,25% e glicose a 0,1% em DPBS. Misture e filtre e esterilize (0,2 μm) a solução. Prepare 10 mL de RPMI-1640 + solução de FBS a 2%, 50 mL de DPBS e meio livre de soro de queratinócitos (KSFM). Adicione suplementos de KSFM e 250 μL de gentamicina a 500 mL de KSFM. Pré-aqueça as soluções a 37 °C antes de usar.
2. Colete a pele de voluntários adultos saudáveis submetidos a cirurgia plástica. As amostras de pele utilizadas têm aproximadamente 10 cm x 15 cm, mas podem variar em tamanho. Mantenha a pele fresca durante o transporte, transportando as amostras de pele em uma caixa de isopor contendo um elemento de resfriamento. Se necessário, a amostra de pele pode ser armazenada a 4 °C durante a noite.
3. Remova a gordura de baixo da seção de pele usando tesouras, bisturis e pinças esterilizadas.
4. Aperte a seção de pele (aproximadamente 10 cm x 15 cm) em uma capa estéril em cima de um prato usando agulhas. Primeiro, limpe a pele com uma gaze esterilizada seca. Em seguida, limpe a pele usando uma gaze esterilizada com etanol 70%.
5. Usando uma plaina de pé, corte a camada superior (epiderme) da seção da pele e coloque-a em uma placa de Petri de 9 cm. Em seguida, adicione imediatamente 25 mL da solução de DPBS/tripsina/glicose (preparada na etapa 1.1) à placa de Petri. Incubar durante 30 min a 37 °C.
6. Usando uma pipeta, remova a solução de DPBS/tripsina/glicose da placa de Petri e adicione 10 mL de RPMI-1640 + 2% de FBS para inativar a tripsina.
7. Usando duas pinças, agora libere as células epidérmicas no meio, raspando e agitando suavemente o compartimento epidérmico e dérmico das seções da pele.
8. Filtrar a suspensão de células epidérmicas através de um filtro metálico (tamanho de orifício de 1 mm) e recolher num tubo de 50 ml. Adicione as seções de pele restantes a um tubo de 50 mL contendo 10 mL de RPMI-1640 sem FBS e vórtice por 10 s. Filtre a suspensão através do filtro metálico para um tubo de 50 ml contendo a suspensão de células epidérmicas. Adicione DPBS a um volume total de 50 mL.
9. Centrifugue a suspensão da célula por 10 min a 450 x g à temperatura ambiente.
10. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células epidérmicas em aproximadamente 10 ml de KSFM a 37 °C, dependendo do tamanho do sedimento celular. Conte as células usando o método de coloração Trypan Blue ao microscópio. O número de células obtidas de uma seção de pele de 10 cm x 15 cm é de aproximadamente 50-100 x 10⁶ células. Para cada balão de cultura^{de 75 cm 2}, transferir 8 x 10⁶ células juntamente com 12 ml de KSFM a 37 °C. Agitar suavemente os frascos de cultura para assegurar uma distribuição uniforme das células.
11. Incubar os queratinócitos em uma incubadora a 37 °C com 100% de umidade e 5% de CO₂. Troque o meio após 2 dias e três vezes por semana. Células de passagem quando a cultura é 70-80% confluente, o que leva aproximadamente 2 semanas, dependendo da taxa de proliferação dos queratinócitos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005-034	Meio de cultura celular
Suplementos KSFM	ThermoFisher Scientific	37000-015	Suplementos para KSFM
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190-144	DPBS sem cálcio e Magnésio
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	Dimetilsulfóxido
Gentamicina	ThermoFisher Scientific	Rolamento 15710-049	Aditivo para meios de cultura celular
Filtro de esterilização	Sartorius	Rolamento 16534	Filtro de seringa com um tamanho de poro de 0,2 μm
tripsina	Sigma-Aldrich	T7409	Usado para tripsinizar células
glicose	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	Nº 61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientific	16000044	Usado para inativar a tripsina
fórceps	-	-	Pinças de qualquer empresa podem ser usado
tesoura	-	-	Tesouras de qualquer empresa podem ser usado
bisturi	Swann Morton	0501	Bisturis de qualquer empresa podem ser usado
70% de etanol	-	-	-
Compressas de gaze	NOBAMED	Rolamento 875420	Compressas de gaze de qualquer fornecedor podem ser usado
Plaina de pé	Credo Solingen	1510	Plaina de pé de qualquer fornecedor pode ser usado
Placas de Petri	TPP	Rolamento 93100	Placas de Petri de qualquer fornecedor can ser usado
Filtro metálico	-	-	Tamanho do furo interno de 1 mm metal filtro
75 cm2 frascos de cultura	Nunc	156499	-
150 cm2 frascos de cultura	Ttp	Rolamento 90151	-
Solução de tripsina-EDTA a 0,05%	ThermoFisher Scientific	Rolamento 25300-062	Usado para tripsinizar células quando Passagem