Isolamento de células-tronco de melanoma: um método para obter células de melanoma CD133 positivas e negativas usando classificação de células ativadas por magnetismo

Resumo

Fonte: Welte, Y. et al. Cultura de células derivadas de pacientes e isolamento de células-tronco cancerígenas putativas CD133+ de melanoma. J. Vis. Exp. (2013)

Este vídeo descreve a técnica de isolamento de células-tronco de melanoma CD133 negativas e positivas de uma linhagem celular primária de melanoma usando classificação de células ativadas por magnetismo. As CSCs de melanoma CD133 positivo são estudadas para entender os mecanismos da tumorigênese do melanoma.

Protocolo

1. Classificação de células magnéticas de células CD133⁺ e CD133^- melanoma usando colunas LS

1. Prepare o tampão MACS contendo 2 mM de EDTA e 5% de FCS em PBS. Misture invertendo e tampão de filtrado estéril usando uma unidade de filtro Steritop-GP de 0,22 μm. Resfrie o tampão a 4-8 °C e desgaseifique antes de usar.
2. Pré-aqueça o meio Accutase, PBS e Quantum 263 a 37 °C.
3. Lave 80% das células confluentes com PBS. Adicione uma quantidade adequada de Accutase e incube até que as células se desprendam da superfície da cultura. Colete as células em um tubo de 50 mL usando o meio Quantum 263.
4. Determine o número de células e centrifugue o número necessário de células por 5 min a 300 x g e 4-8 °C. (De acordo com o protocolo de Miltenyi, um máximo de 2x 10⁹ células podem ser carregadas por coluna LS. Os números ótimos específicos da linhagem celular devem ser determinados e podem ser consideravelmente menores.) Aspirar completamente o sobrenadante.
5. Ressuspenda no máximo 1x 10⁸ células com tampão MACS de 350 μL (para números de células mais altos, aumente a escala de todos os volumes de tampão MACS, reagente bloqueador FcR, CD133/1-biotina e microesferas anti-biotina de acordo).
6. Adicione 100 μL de reagente de bloqueio FcR.
7. Adicione 50 μL de CD133/1-Biotina. Misture bem usando um vórtice e incube a 4-8 °C por 10 min.
8. Lave as células adicionando 10 mL de tampão MACS e centrifugue por 5 min a 300 x g e 4-8 ° C. Aspire o sobrenadante completamente.
9. Repita a etapa de lavagem (1.8).
10. Ressuspenda o pellet celular com tampão MACS de 400 μL.
11. Adicione 100 μL de microesferas anti-biotina. Misture bem usando um vórtice e incube a 4-8 ° C por 15 min.
12. Enquanto isso, prepare o separador MACS para separação magnética. Conecte o QuadroMACS ao MACS Separator Multi Stand. Insira o número necessário de colunas LS com as asas da coluna para a frente no campo magnético do QuadroMACS. Coloque um filtro de pré-separação (com malha de nylon de 30 μm) em cada coluna LS e um tubo de coleta apropriado (15 mL ou 50 mL) sob cada coluna. Prepare o filtro e a coluna enxaguando com 3 mL de tampão MACS. Descarte o fluxo.
13. Lave as células adicionando 10 mL de tampão MACS e centrifugue por 5 min a 300 x g e 4-8 ° C. Aspire o sobrenadante completamente.
14. Ressuspenda as células com tampão MACS de 500 μL e aplique a suspensão da célula na coluna LS com o filtro de pré-separação.
15. Lave três vezes com 3 mL de tampão MACS por coluna. Adicione o novo buffer apenas quando o reservatório da coluna estiver vazio.
16. O efluente total coletado contém a fração de células CD133^- não marcada.
17. Descarte o filtro de pré-separação, remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo de coleta adequado.
18. Aplique 5 mL de tampão MACS. Lave imediatamente as células CD133⁺ marcadas empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna.
19. Para aumentar a pureza da fração negativa, aplique a suspensão celular em uma nova coluna LS equilibrada inserida no QuadroMACS. O efluente contém a fração CD133^-.
20. Descarte as colunas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007
Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético desidratado (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-395
Kit de microesferas CD133 indireto humano	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-895	Inclui: CD133 / 1 (AC133) -Biotina, MicroBeads anti-Biotina e Reagente de Bloqueio FcR
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
Suporte múltiplo do separador MACS	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
Colunas de Separação MACS 25 Colunas LS	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-401
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-976