Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Isolamento de melanócitos e fibroblastos
- Eutanasiar filhotes C57Bl/6J machos e/ou fêmeas de 0 a 4 dias de idade por decapitação e remover as extremidades dos camundongos sacrificados usando tesouras cirúrgicas.
- Em um gabinete de fluxo laminar, role brevemente o tronco de cada camundongo em uma placa de Petri estéril contendo 70% de etanol. Remova o tronco do etanol e coloque-o em uma placa de Petri vazia e estéril.
- Usando uma tesoura cirúrgica, esterilizada em etanol a 70%, faça uma incisão na pele do lado ventral do tronco, começando do pescoço até a cauda. Retire a pele do tronco do camundongo usando uma pinça estéril.
- Coloque a pele, com a derme voltada para baixo, em um prato de 6 poços contendo 3 mL de 1x solução antibiótica/antimicótica e incube em temperatura ambiente por 2-3 min.
- Ligue o picador de tecidos com as seguintes configurações: Espessura da fatia: 1 μm; Força da lâmina: ~60% do máximo; Velocidade: ~50% do máximo.
- Transfira a pele, com o lado da derme para baixo, para um disco picador de tecido estéril e passe a pele completamente pelo picador de tecido ativado 3 vezes.
- Transfira a pele homogeneizada para um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 3 mL de tampão de digestão da pele (prepare 3 mL de tampão de digestão da pele fresca contendo 10% de soro bovino fetal, 1% de solução de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 10 mg/mL de colagenase tipo I, 0,25% de tripsina suína e 0,02 mg/mL de desoxirribonuclease I em RPMI 1640). Misture a suspensão resultante pipetando para cima e para baixo 10-15 vezes com uma micropipeta P1000.
- Tampe o tubo cônico e incube a amostra em banho-maria a 37 °C por 15 min, invertendo o tubo a cada 3-5 min.
- Pulverizar as células da homogeneização da pele centrifugando o tubo cónico num rotor de balde oscilante a 750 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Usando uma micropipeta P1000, remova lenta e completamente o Tampão de Digestão da Pele, tomando cuidado para não perturbar o pellet.
nota: Uma parte da pele inteira pode ser salva nesta fase e usada como controle para confirmação da pureza celular. Coe essas células através de um filtro de células de 70 μm e processe mais.
- Ressuspenda completamente o pellet celular em 1 mL de meio de melanócitos pipetando para cima e para baixo 15-20 vezes com uma micropipeta P1000. Adicione a solução celular resultante gota a gota a um poço não revestido de um prato de 6 poços contendo 1 mL de meio de melanócitos.
- Colocar o homogeneizado de pele em placas numa incubadora de cultura de tecidos regulada para 37 °C e 5% de CO2. Permitir que as culturas incubem por 40 min.
nota: Durante esse período, alguns fibroblastos no homogeneizado da pele aderirão à placa não revestida, enquanto os melanócitos e queratinócitos permanecem em suspensão.
- Transfira o sobrenadante da cultura do prato não revestido para um poço de um prato de 6 poços pré-lavado e revestido com colágeno. Adicione G418 ao meio de forma que a concentração final seja de 100 ng / mL.
- Adicione 2 mL de meio de fibroblastos a um poço da placa não revestida, agora contendo fibroblastos aderentes.
- Incubar ambas as culturas durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos ajustada a 37 ° C e 5% de CO2.
- Aspire separadamente o meio e quaisquer detritos de cada cultura, 16-24 h após o plaqueamento. Lave cada prato duas vezes com 1 mL de PBS estéril e, em seguida, adicione 2 mL de meio de melanócitos frescos mais 100 ng / mL G418 à cultura de melanócitos e 2 mL de meio de fibroblastos fresco à cultura de fibroblastos. (Prepare 6 mL de Melanocyte Medium fresco contendo 10% de soro fetal bovino, 7% de soro de cavalo, solução de penicilina/estreptomicina a 1%, L-glutamina a 1%, AMP cíclico dibutiril 0,5 mM (dbcAMP), 20 nM de tetradecanoilforbol 13-acetato (TPA) e 200 pM de toxina da cólera (CT) no meio do Nutrient Mix F-12 Ham.
NOTA: As soluções concentradas de estoque dbcAMP, TPA e CT podem ser feitas, aliquotadas e armazenadas por >1 ano a -80 °C. Os meios básicos sem esses componentes podem ser armazenados por até 1 mês a 4 °C.
Prepare 4 mL de meio de fibroblastos contendo 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de L-glutamina no meio Eagle modificado de Dulbecco. Este meio pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês)
- Após as culturas de melanócitos terem sido tratadas com G418 por 48 h, lave as células duas vezes com 1 mL de PBS estéril e adicione 2 mL de meio de melanócitos frescos sem G418 à cultura.
nota: Como os fibroblastos na cultura de melanócitos continuam a morrer após o tratamento com G418, lave o prato com PBS estéril para remover as células mortas e adicionar meios de melanócitos frescos. As culturas de melanócitos e fibroblastos devem ser passadas quando atingirem 70-80% de confluência.
