Preparação de vírion de poliomavírus de células de Merkel recombinante (MCPyV): uma técnica para produzir vírion MCPyV recombinante de alto título

Resumo

Fonte: Wei Liu et al. Infecção e Detecção de Poliomavírus de Células Merkel, J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, mostramos a preparação do poliomavírus de células de Merkel ou vírions MCPyV usando células 273TT. Essa tecnologia ajuda a produzir títulos altos dos vírions MCPyV recombinantes.

Protocolo

1. Preparação de vírion MCPyV recombinante

1. Digerir 50 μg de plasmídeo pR17b (portador do genoma MCPyV) com 250 U de BamHI-HF em um volume de 200 μL (4 h a 37 ° C) para separar o genoma viral da estrutura do vetor (Figura 1).
2. Adicione 1200 μL de tampão PB (suplementado com 10 μL de NaAc 3 M, pH 5,2) ao DNA digerido e purifique em 2 colunas de centrifugação miniprep (capacidade de DNA de 20 μg). Eluir o plasmídeo pR17b digerido de cada coluna com 200 μL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH8,0, 1 mM EDTA).
3. Preparar a reação de ligadura em tubo centrífugo de 50 ml. Adicione 400 μL de DNA de plasmídeo purificado da etapa 1.2, 8,6 mL de tampão ligase T4 1,05x e 6 μL de ligase T4 de alta concentração. Incubar a 16 °C durante a noite.
4. Adicione 45 mL de tampão PB (suplementado com 10 μL de NaAc 3 M, pH 5,2) à ligadura e use um coletor de vácuo para carregar através de 2 colunas de centrifugação miniprep. Eluir cada coluna com 50 μL de tampão TE. Espere um rendimento de cerca de 30 μg de DNA.
5. No final da tarde/noite, semeie 6 x 10⁶ células 293TT em um prato de 10 cm contendo meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de L-glutamina sem higromicina B.
6. Na manhã seguinte, certifique-se de que as células estejam cerca de 50% confluentes. Transfecto usando 66 μL de reagente de transfecção (1,1 μL / cm²), 12 μg de DNA R17b isolado MCPyV religado da etapa 1.4, 8,4 μg de plasmídeo de expressão ST pMtB e 9,6 μg de plasmídeo de expressão LT pADL.
7. Quando as células transfectadas estiverem quase confluentes, no dia seguinte, tripsinize as células e transfira-as para uma placa de 15 cm para expansão contínua.
8. Opcionalmente, pegue um pequeno número de células 293TT após a expansão e realize a coloração IF para MCPyV LT (CM2B4) e VP1 (MCV VP1 coelho) para determinar a eficiência da transfecção. Nesta fase, os sinais nucleares LT podem ser visíveis, mas a expressão de VP1 provavelmente não será detectável.
9. Quando a placa de 15 cm se tornar quase confluente (geralmente 5-6 dias após a transfecção inicial), transfira as células para três placas de 15 cm. Colha as células das placas de 15 cm quando elas se tornarem quase confluentes e siga o protocolo de colheita do vírus abaixo.
   nota: Opcionalmente, execute o controle de qualidade IF conforme descrito na etapa 1.8. A maioria das células deve ser positiva para MCPyV LT e VP1 nesta fase.
10. Para colher o vírus, tripsinize as células, gire a 180 x g por 5 min em RT e remova o sobrenadante. Adicione um volume de pellet celular de DPBS-Mg (DPBS com 9,5 mM MgCl₂ e 1x antibiótico-antimicótico). Em seguida, adicione 25 mM de sulfato de amônio (de uma solução estoque de pH 9 1 M) seguido de 0,5% de Triton X-100 (de uma solução estoque de 10%), 0,1% de Benzonase e 0,1% de uma DNase dependente de ATP. Misture bem e incube a 37 °C durante a noite.
11. Incube a mistura por 15 min no gelo e, em seguida, adicione 0,17 volume de 5M NaCl. Misture e incube no gelo por mais 15 min. Gire por 10 min a 12.000 x g em uma centrífuga a 4 °C. Se o sobrenadante não estiver claro, inverta suavemente o tubo e repita a etapa de centrifugação. Transferir o sobrenadante para um novo tubo.
12. Ressuspenda o pellet usando um volume de DPBS suplementado com NaCl 0,8 M e gire novamente, conforme descrito na etapa 1.11.
13. Combine os sobrenadantes das etapas 1.11 e 1.12 e gire mais uma vez, conforme descrito na etapa 1.11.
14. Despeje gradientes de iodixanol em tubos de polialômero de parede fina de 5 mL por subjacto (27%, depois 33%, depois 39%) ~ 0,7 mL em etapas usando uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha longa ou uma pipeta p1000.
15. Carregue 3 mL de sobrenadante contendo vírus clarificado no gradiente de iodixanol preparado.
16. Gire por 3,5 h a 234.000 x g e 16 °C em um rotor SW55ti. Defina a aceleração e a desaceleração para lentas.
17. Após a ultracentrifugação, coletar 12 frações em tubos siliconizados (cada fração é ~ 400 μL).
18. Analisar as frações para a presença de vírus por reagente dsDNA e/ou Western blot para VP1 (MCV VP1 coelho). Agrupe frações de gradiente com conteúdo de pico de dsDNA e/ou VP1 e caracterize o estoque por PCR quantitativo para calcular o equivalente do genoma viral. Armazene o estoque de vírion MCPyV a -80 °C.

Resultados

Figura 1. Produção de vírion MCPyV usando genoma viral recombinante.(A) Um mapa de plasmídeo de pR17b (plasmídeo do genoma MCPyV). (B) Uma imagem representativa de uma amostra de vírion MCPyV colhida e purificada em um gradiente. A seta marca a faixa de vírions MCPyV concentrados no núcleo do gradiente. (C) O número de cópias do genoma viral em cada ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio DMEM/F12	Thermo Fisher Científico	11330-032
Proteína EGF Humana Recombinante, FC	Sistemas de P&D	236-EG-200	Armazene a -80 graus Celsius
CHIR99021	Cayman Chemical	Rolamento 13122	Armazene a -80 graus Celsius
CHIR99021	sigma	SML1046	Armazene a -80 graus Celsius
Colagenase tipo IV	Thermo Fisher Científico	17104019
Dissipação II	Roche	4942078001
Antibiótico-Antimicótico	Thermo Fisher Científico	15240-062	Proteger da luz
Meio DMEM	Thermo Fisher Científico	11965084
Paraformaldeído	sigma	Pág. 6148
Anti-MCPyV LT (CM2B4)	Santa Cruz	SC-136172	Lote # B2717
Coelho MCV VP1		Soro policlonal de coelho #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm