Visualização da expressão de proteínas baseada em CUBIC: um procedimento para visualizar a expressão de proteínas em biópsias de pele de camundongos de espessura total

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação do tecido transparente da pele do rato

NOTA: Todos os camundongos usados neste estudo estavam em um fundo genético C57BL/6

1. Coleção de tecido de pele de camundongo.
   1. Eutanasiar humanamente os camundongos por luxação cervical.
   2. Remova cuidadosamente os pelos da área relevante da pele com um aparador, tomando cuidado para não ferir a pele.
   3. Lave a pele para descontaminar com etanol 70% em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   4. Levante a pele dorsal do pescoço com uma pinça e faça uma incisão com uma tesoura.
   5. Disseque uma grande área da pele dorsal do rato (aproximadamente 1,5 x 4 cm).
   6. Alise a pele, com o lado da derme para baixo, em um papel de filtro e anote a orientação ântero-posterior da amostra.
   7. Apare o papel de filtro ao redor da pele dissecada e coloque em um tubo de 15 mL cheio de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) recém-preparada em PBS.
   8. Fixe por 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite na geladeira a 4 ° C.
   9. Lave a pele 2x 5 min em PBS em tubo de 15 mL.
      nota: Os seguintes (1.1.10 - 1.1.12) são etapas opcionais para o armazenamento de tecido a longo prazo.
   10. Desidratar a pele dissecada em PBS com concentração crescente de etanol (25%, 50%, 70%) em um tubo de 15 mL durante as etapas de lavagem de 1 hora em temperatura ambiente.
   11. Armazene a pele desidratada em etanol a 70% em PBS em um tubo de 15 mL a 4 ° C até o uso posterior.
   12. Quatro horas antes da limpeza, reidratar o tecido cutâneo em PBS com concentração decrescente de etanol (70%, 50%, 25%, 0%) em um tubo de 15 mL durante as etapas de lavagem de 1 hora em temperatura ambiente.
2. Limpando as biópsias de pele do camundongo
   1. Preparar a solução de limpeza CUBIC1 dissolvendo 3,85 g de ureia e 3,85 g de N,N,N',N'-tetraquis(2-hidroxipropil)etilenodiamina em 5,38 ml de água destilada num aquecedor regulado para 60-70 °C. Utilizar um agitador quente.
   2. Adicionar 2,31 g de éter mono-p-isooctilfenílico de polietilenoglicol/Triton X-100 à solução quando esta estiver límpida e arrefecida até à temperatura ambiente.
   3. Corte a pele do rato com uma lâmina de barbear afiada em biópsias de dimensões aproximadas de 0,2 x 0,5 cm e mergulhe em 5 ml de solução de limpeza CUBIC1 num tubo de 15 ml. Para otimizar a visualização dos folículos capilares, certifique-se de que o lado mais longo da biópsia seja cortado ao longo da direção ântero-posterior da amostra.
   4. Colocar sobre uma plataforma rotativa num forno de hibridização a 37 °C.
   5. Troque a solução de limpeza após 7 dias. Prepare uma nova solução de CUBIC1 antes de usar.
   6. Verifique a transparência do tecido após 7 dias. Se necessário, deixe as biópsias na solução de limpeza CUBIC1 até que o tecido esteja completamente transparente.
   7. Assim que a biópsia de pele estiver transparente, remova a solução CUBIC1 e adicione 4 mL de 1x PBS para lavar o tecido 4 vezes por 6 horas a 37 °C.
   8. Lave o tecido cutâneo em sacarose a 20% p/v em PBS em um tubo de 15 ml por 4 horas a 37 °C.
   9. Congele o tecido no meio de montagem Composto de Temperatura Ótima de Corte (OCT) em um tubo de 15 mL durante a noite em um freezer a -80 °C.
      nota: Esta etapa aumentará a permeabilidade da biópsia para penetração de anticorpos nas etapas subsequentes.

2. Coloração por imunofluorescência

1. Descongele o tecido de (etapa 1.2.9) à temperatura ambiente por 2 a 3 horas.
2. Lave o tecido no tubo de 15 mL com 5 mL de PBS por 8 horas em temperatura ambiente para remover o composto OCT.
3. Transfira as biópsias para um tubo de 2 mL e incube o tecido em 1 mL de anti-queratina14 de coelho ou anticorpo anti-Ki67 de coelho, ambos diluídos a 1:100 em PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) por 3 dias em um shaker em um forno a 37 ° C.
4. Transfira as biópsias para um tubo de 15 mL e lave o tecido 4 vezes por 6 horas em 5 mL de PBST em um shaker em um forno a 37 ° C.
5. Transfira as biópsias para um tubo de 2 mL, adicione 1 mL de anticorpo secundário Alexa594 de coelho diluído a 1:100 em PBST e incube 3 dias em uma coqueteleira em um forno a 37 ° C.
6. Transfira as biópsias para um tubo de 15 mL e lave o tecido 4 vezes por 6 horas em 5 mL de PBST em um shaker em um forno a 37 ° C.
7. Transfira as biópsias para um tubo de 2 ml, adicione 1 ml de solução de contracoloração nuclear de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1:1.000) em PBST e incube durante a noite num shaker num forno a 37 °C.
8. Remova a solução de contracoloração DAPI e adicione 1 mL de PBST ao tubo de 2 mL para lavar o tecido 4 vezes por 6 horas em um shaker em um forno a 37 °C.
   nota: Etapa opcional: As biópsias podem ser armazenadas no escuro em 1x PBS com 0,02% de azida sódica por pelo menos 3 semanas.

3. Exames de imagem

1. Prepare a solução de limpeza CUBIC2, que contém 50% (p / v) de sacarose, 25% (p / v) de ureia, 10% (p / v) de 2,2 ', 2'-nitrilotrietanol e 0,1% (v / v) Triton X-100.
2. Incubar o tecido cutâneo em 1 ml de solução de CUBIC2 num tubo de 2 ml num shaker durante 24 horas num forno a 37 °C. Esta etapa equilibrará o índice de refração do tecido.
3. Verifique a clareza do tecido. Uma vez desobstruída, posicione toda a biópsia de pele (0,2 x 0,5 cm) em seu lado mais comprido sobre uma lamínula de vidro, de modo que a direção do comprimento dos folículos pilosos seja paralela à superfície da lamínula (#1 24 x 60 mm).
   nota: Etapa opcional: As biópsias coradas com anticorpos podem ser armazenadas na solução CUBIC2 por cerca de 7 dias. As biópsias coradas com vermelho do Nilo só podem ser armazenadas na solução CUBIC2 por até 1 dia e devem ser visualizadas o mais rápido possível.
4. Preparar a câmara de imagem (Figura 1).
   NOTA: Os consumíveis necessários para a preparação da câmara de imagem são: tachinha azul, massinha ou similar, e 2 lamínulas (24 x 50 mm) (Figura 1A).
   1. Prepare duas tiras finas de aderência azul (diâmetro de aproximadamente 1 mm x 2 cm) e duas lamínulas (Figura 1B).
   2. Coloque tiras de aderência azuis em uma lamínula, deixando espaço suficiente para a biópsia de pele (Figura 1C, etapa 3.4.3).
   3. Coloque a biópsia de pele entre as tiras na lamínula em uma gota de solução de CUBIC2 (Figura 1C).
   4. Cubra a biópsia de pele com a segunda lamínula (Figura 1D).
5. Coloque a câmara de imagem com a biópsia de pele montada no estágio de um microscópio confocal e mova o tecido para o caminho da luz.
6. Escaneie a amostra usando uma fonte de luz de mercúrio ou halogênio e filtros de epifluorescência padrão (por exemplo, DAPI/GFP/CY3/CY5) para identificar regiões de interesse coradas com fluorescência.
7. Regiões de interesse de imagem usando uma objetiva de 10X e 20X (NA 0,75) e técnicas de imagem de fluorescência confocal padrão (por exemplo, com amostras coradas com DAPI iluminam com um laser de 405 nm e coletam sinal de fluorescência entre 425-475 nm, e com Alexa Fluor 594 ou amostras coradas com Vermelho do Nilo iluminam com um laser de 561 nm e coletam sinal de fluorescência entre 570-620 nm).
8. Gere pilhas Z de imagem de cada região de interesse usando o software de aquisição de imagem de pilha Z do microscópio (por exemplo, usando o software de imagem de elementos NIS 4.13, conforme descrito abaixo).
   1. Garanta a potência ideal do laser e selecione as configurações PMT HV/Offset para coletar a fluorescência da amostra.
   2. Abra a barra de ferramentas "Aquisição ND" em "Controles de aquisição".
   3. Selecione a guia "Configuração da série Z" (certifique-se de que todas as outras guias estejam desmarcadas).
   4. Durante a varredura ao vivo, concentre-se na parte superior da amostra e pressione o botão "Superior".
   5. Concentre-se na parte inferior da amostra e pressione o botão "Inferior".
   6. Insira o tamanho do passo necessário (ou pressione o botão de tamanho do passo otimizado).
   7. Pressione o botão "Executar agora".
   8. Salve as pilhas Z resultantes como pilhas de imagens Tiff individuais (1 fluorocromo por pilha Z de imagem).
9. Use pilhas Z de imagem para reconstruir regiões de volume 3D de interesse usando software de análise 3D (por exemplo, usando Imaris x64 7.2.3 conforme descrito abaixo).
   1. Inicie o software de análise.
   2. Escolha o botão "Passar" na barra de ferramentas para geração de volume 3D.
   3. Abra a primeira pilha Z da imagem colorida (por exemplo, DAPI).
   4. Use a ferramenta 'adicionar canal' para adicionar canais de cores adicionais, um canal por fluorocromo. Assim, uma amostra contendo fluorocromos DAPI e Alexa Fluor 594 exigirá dois canais.
   5. Use a ferramenta "Propriedades da imagem" para definir as dimensões corretas de pixel (voxel) (XYZ), conforme determinado em 3.7 acima.
   6. Use a ferramenta "Ajuste de exibição" para alterar as cores do canal conforme necessário (por exemplo, defina o canal DAPI para azul, o canal Alexa Fluor 594 para vermelho).
   7. Para posicionar o volume 3D na janela de imagem, use o mouse do computador para clicar e arrastar o volume conforme necessário.
   8. Use a ferramenta "Instantâneo" na barra de ferramentas para gerar capturas de tela da imagem 3D.
   9. Use a ferramenta "Animação" na barra de ferramentas para gerar filmes de rotação de amostra 3D.

Figura 1: Preparação da câmara de imagem. R: Os consumíveis necessários para a preparação da câmara de imagem são blue tack, massinha ou similar e 2 lamínulas (24 x 50 mm). B: Prepare duas tiras finas de aderência azul (diâmetro de aproximadamente 2 mm x 2 cm) e duas lamínulas. C: Coloque tiras de aderência azuis em uma lamínula, deixando espaço suficiente para a biópsia de pele. Coloque a biópsia de pele em uma gota de solução CUBIC2 entre as duas tiras. D: Coloque a segunda lamínula em tiras de aderência azuis para cobrir a biópsia de pele.