Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Preparação do tecido transparente da pele do rato
NOTA: Todos os camundongos usados neste estudo estavam em um fundo genético C57BL/6
- Coleção de tecido de pele de camundongo.
- Eutanasiar humanamente os camundongos por luxação cervical.
- Remova cuidadosamente os pelos da área relevante da pele com um aparador, tomando cuidado para não ferir a pele.
- Lave a pele para descontaminar com etanol 70% em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Levante a pele dorsal do pescoço com uma pinça e faça uma incisão com uma tesoura.
- Disseque uma grande área da pele dorsal do rato (aproximadamente 1,5 x 4 cm).
- Alise a pele, com o lado da derme para baixo, em um papel de filtro e anote a orientação ântero-posterior da amostra.
- Apare o papel de filtro ao redor da pele dissecada e coloque em um tubo de 15 mL cheio de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) recém-preparada em PBS.
- Fixe por 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite na geladeira a 4 ° C.
- Lave a pele 2x 5 min em PBS em tubo de 15 mL.
nota: Os seguintes (1.1.10 - 1.1.12) são etapas opcionais para o armazenamento de tecido a longo prazo.
- Desidratar a pele dissecada em PBS com concentração crescente de etanol (25%, 50%, 70%) em um tubo de 15 mL durante as etapas de lavagem de 1 hora em temperatura ambiente.
- Armazene a pele desidratada em etanol a 70% em PBS em um tubo de 15 mL a 4 ° C até o uso posterior.
- Quatro horas antes da limpeza, reidratar o tecido cutâneo em PBS com concentração decrescente de etanol (70%, 50%, 25%, 0%) em um tubo de 15 mL durante as etapas de lavagem de 1 hora em temperatura ambiente.
- Limpando as biópsias de pele do camundongo
- Preparar a solução de limpeza CUBIC1 dissolvendo 3,85 g de ureia e 3,85 g de N,N,N',N'-tetraquis(2-hidroxipropil)etilenodiamina em 5,38 ml de água destilada num aquecedor regulado para 60-70 °C. Utilizar um agitador quente.
- Adicionar 2,31 g de éter mono-p-isooctilfenílico de polietilenoglicol/Triton X-100 à solução quando esta estiver límpida e arrefecida até à temperatura ambiente.
- Corte a pele do rato com uma lâmina de barbear afiada em biópsias de dimensões aproximadas de 0,2 x 0,5 cm e mergulhe em 5 ml de solução de limpeza CUBIC1 num tubo de 15 ml. Para otimizar a visualização dos folículos capilares, certifique-se de que o lado mais longo da biópsia seja cortado ao longo da direção ântero-posterior da amostra.
- Colocar sobre uma plataforma rotativa num forno de hibridização a 37 °C.
- Troque a solução de limpeza após 7 dias. Prepare uma nova solução de CUBIC1 antes de usar.
- Verifique a transparência do tecido após 7 dias. Se necessário, deixe as biópsias na solução de limpeza CUBIC1 até que o tecido esteja completamente transparente.
- Assim que a biópsia de pele estiver transparente, remova a solução CUBIC1 e adicione 4 mL de 1x PBS para lavar o tecido 4 vezes por 6 horas a 37 °C.
- Lave o tecido cutâneo em sacarose a 20% p/v em PBS em um tubo de 15 ml por 4 horas a 37 °C.
- Congele o tecido no meio de montagem Composto de Temperatura Ótima de Corte (OCT) em um tubo de 15 mL durante a noite em um freezer a -80 °C.
nota: Esta etapa aumentará a permeabilidade da biópsia para penetração de anticorpos nas etapas subsequentes.
2. Coloração por imunofluorescência
- Descongele o tecido de (etapa 1.2.9) à temperatura ambiente por 2 a 3 horas.
- Lave o tecido no tubo de 15 mL com 5 mL de PBS por 8 horas em temperatura ambiente para remover o composto OCT.
- Transfira as biópsias para um tubo de 2 mL e incube o tecido em 1 mL de anti-queratina14 de coelho ou anticorpo anti-Ki67 de coelho, ambos diluídos a 1:100 em PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) por 3 dias em um shaker em um forno a 37 ° C.
- Transfira as biópsias para um tubo de 15 mL e lave o tecido 4 vezes por 6 horas em 5 mL de PBST em um shaker em um forno a 37 ° C.
- Transfira as biópsias para um tubo de 2 mL, adicione 1 mL de anticorpo secundário Alexa594 de coelho diluído a 1:100 em PBST e incube 3 dias em uma coqueteleira em um forno a 37 ° C.
- Transfira as biópsias para um tubo de 15 mL e lave o tecido 4 vezes por 6 horas em 5 mL de PBST em um shaker em um forno a 37 ° C.
- Transfira as biópsias para um tubo de 2 ml, adicione 1 ml de solução de contracoloração nuclear de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1:1.000) em PBST e incube durante a noite num shaker num forno a 37 °C.
- Remova a solução de contracoloração DAPI e adicione 1 mL de PBST ao tubo de 2 mL para lavar o tecido 4 vezes por 6 horas em um shaker em um forno a 37 °C.
nota: Etapa opcional: As biópsias podem ser armazenadas no escuro em 1x PBS com 0,02% de azida sódica por pelo menos 3 semanas.
3. Exames de imagem
- Prepare a solução de limpeza CUBIC2, que contém 50% (p / v) de sacarose, 25% (p / v) de ureia, 10% (p / v) de 2,2 ', 2'-nitrilotrietanol e 0,1% (v / v) Triton X-100.
- Incubar o tecido cutâneo em 1 ml de solução de CUBIC2 num tubo de 2 ml num shaker durante 24 horas num forno a 37 °C. Esta etapa equilibrará o índice de refração do tecido.
- Verifique a clareza do tecido. Uma vez desobstruída, posicione toda a biópsia de pele (0,2 x 0,5 cm) em seu lado mais comprido sobre uma lamínula de vidro, de modo que a direção do comprimento dos folículos pilosos seja paralela à superfície da lamínula (#1 24 x 60 mm).
nota: Etapa opcional: As biópsias coradas com anticorpos podem ser armazenadas na solução CUBIC2 por cerca de 7 dias. As biópsias coradas com vermelho do Nilo só podem ser armazenadas na solução CUBIC2 por até 1 dia e devem ser visualizadas o mais rápido possível.
- Preparar a câmara de imagem (Figura 1).
NOTA: Os consumíveis necessários para a preparação da câmara de imagem são: tachinha azul, massinha ou similar, e 2 lamínulas (24 x 50 mm) (Figura 1A).
- Prepare duas tiras finas de aderência azul (diâmetro de aproximadamente 1 mm x 2 cm) e duas lamínulas (Figura 1B).
- Coloque tiras de aderência azuis em uma lamínula, deixando espaço suficiente para a biópsia de pele (Figura 1C, etapa 3.4.3).
- Coloque a biópsia de pele entre as tiras na lamínula em uma gota de solução de CUBIC2 (Figura 1C).
- Cubra a biópsia de pele com a segunda lamínula (Figura 1D).
- Coloque a câmara de imagem com a biópsia de pele montada no estágio de um microscópio confocal e mova o tecido para o caminho da luz.
- Escaneie a amostra usando uma fonte de luz de mercúrio ou halogênio e filtros de epifluorescência padrão (por exemplo, DAPI/GFP/CY3/CY5) para identificar regiões de interesse coradas com fluorescência.
- Regiões de interesse de imagem usando uma objetiva de 10X e 20X (NA 0,75) e técnicas de imagem de fluorescência confocal padrão (por exemplo, com amostras coradas com DAPI iluminam com um laser de 405 nm e coletam sinal de fluorescência entre 425-475 nm, e com Alexa Fluor 594 ou amostras coradas com Vermelho do Nilo iluminam com um laser de 561 nm e coletam sinal de fluorescência entre 570-620 nm).
- Gere pilhas Z de imagem de cada região de interesse usando o software de aquisição de imagem de pilha Z do microscópio (por exemplo, usando o software de imagem de elementos NIS 4.13, conforme descrito abaixo).
- Garanta a potência ideal do laser e selecione as configurações PMT HV/Offset para coletar a fluorescência da amostra.
- Abra a barra de ferramentas "Aquisição ND" em "Controles de aquisição".
- Selecione a guia "Configuração da série Z" (certifique-se de que todas as outras guias estejam desmarcadas).
- Durante a varredura ao vivo, concentre-se na parte superior da amostra e pressione o botão "Superior".
- Concentre-se na parte inferior da amostra e pressione o botão "Inferior".
- Insira o tamanho do passo necessário (ou pressione o botão de tamanho do passo otimizado).
- Pressione o botão "Executar agora".
- Salve as pilhas Z resultantes como pilhas de imagens Tiff individuais (1 fluorocromo por pilha Z de imagem).
- Use pilhas Z de imagem para reconstruir regiões de volume 3D de interesse usando software de análise 3D (por exemplo, usando Imaris x64 7.2.3 conforme descrito abaixo).
- Inicie o software de análise.
- Escolha o botão "Passar" na barra de ferramentas para geração de volume 3D.
- Abra a primeira pilha Z da imagem colorida (por exemplo, DAPI).
- Use a ferramenta 'adicionar canal' para adicionar canais de cores adicionais, um canal por fluorocromo. Assim, uma amostra contendo fluorocromos DAPI e Alexa Fluor 594 exigirá dois canais.
- Use a ferramenta "Propriedades da imagem" para definir as dimensões corretas de pixel (voxel) (XYZ), conforme determinado em 3.7 acima.
- Use a ferramenta "Ajuste de exibição" para alterar as cores do canal conforme necessário (por exemplo, defina o canal DAPI para azul, o canal Alexa Fluor 594 para vermelho).
- Para posicionar o volume 3D na janela de imagem, use o mouse do computador para clicar e arrastar o volume conforme necessário.
- Use a ferramenta "Instantâneo" na barra de ferramentas para gerar capturas de tela da imagem 3D.
- Use a ferramenta "Animação" na barra de ferramentas para gerar filmes de rotação de amostra 3D.
