Visualização da expressão de proteínas baseada em CUBIC: um procedimento para visualizar a expressão de proteínas em biópsias de pele de camundongos de espessura total

Abstract

Fonte: Liang, H. et al. O protocolo CUBIC visualiza a expressão de proteínas em resolução de célula única em preparações cutâneas de montagem inteira. J. Vis. Exp (2016)

Este vídeo descreve a técnica de visualização baseada em CUBIC, uma técnica de imagem dependente de limpeza de tecido para avaliação visual da expressão de proteínas em biópsias de pele de montagem total em resolução de célula única em 3D. Este protocolo tecnicamente simples permite a visualização de proteínas da pele sem preparar cortes de pele.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação do tecido transparente da pele do rato

NOTA: Todos os camundongos usados neste estudo estavam em um fundo genético C57BL/6

1. Coleção de tecido de pele de camundongo.
   1. Eutanasiar humanamente os camundongos por luxação cervical.
   2. Remova cuidadosamente os pelos da área relevante da pele com um aparador, tomando cuidado para não ferir a pele.
   3. Lave a pele para descontami....

Results

Figura 1: Preparação da câmara de imagem. R: Os consumíveis necessários para a preparação da câmara de imagem são blue tack, massinha ou similar e 2 lamínulas (24 x 50 mm). B: Prepare duas tiras finas de aderência azul (diâmetro de aproximadamente 2 mm x 2 cm) e duas lamínulas. C: Coloque tiras de aderência azuis em uma lamínula, deixando espaço suficiente para a bió.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	Pág. 6418
Etanol 96% (não desnaturado)	Fornecimento de produtos químicos	UN1170
4',6-diamidino-2-fenilindo (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N'-tetraquis(2-hidroxipropil) etilenodiamina	Merck Millipore	Rolamento 821940
Éter mono-p-isooctilfenílico de polietilenoglicol	Merck Millipore	648462
Tritão X-100	Merck Millipore	648462
sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
Temperatura ideal de corte (OUTUBRO) Composto	Tecido-Tek	Nº 4583
anticorpo anti-queratina14	Covance	PRB-155P
anticorpo anti-Ki67	Abcam	ab16667
Burro anti-coelho Alexa 594	Tecnologias da Vida	A21207
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D2650
ureia	Merck Millipore	Nº 66612
2,2′,2′'-nitrilotrietanol	Merck Millipore	137002
Microscópio Confocal	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Microscópio Confocal
cruZer6 Aparador de rosto	Braun	Braun cruZer6 Rosto
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	438456