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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Queratinócitos Humanos Primários Geneticamente Modificados
NOTA: Use células fênix anfotrópicas cultivadas em meio DMEM completo [DMEM + 10% de soro fetal bovino (FBS) + caneta/estreptococos] para produzir vírus para infectar queratinócitos humanos primários. Os genes de empacotamento viral que codificam proteínas como gag-pol e envelope são integrados de forma estável ao genoma da célula fênix, o que permite a produção de vírus quando transfectado com um vetor retroviral. As células Phoenix podem ser transfectadas com alta eficiência, permitindo uma alta produção de títulos virais. Os vírus produzidos a partir desta linha de embalagem também podem infectar uma grande variedade de células de mamíferos, incluindo humanos.
- Dia 1: Um dia antes da transfecção, semeie células de fênix em uma placa de 6 poços a uma densidade de 800.000 células por poço em meio DMEM completo.
- Dia 2: No dia da transfecção, use 3 μg de vetores retrovirais por poço. Alíquota de 3 μg de vetor retroviral para um tubo de 1,5 ml. Use uma mistura de 100 μL de DMEM mais 6 μL de reagente de transfecção para cada 3 μg de vetor. Misture 6 μL de reagente de transfecção com 100 μL de DMEM em um tubo de 1,5 mL. (Os vetores retrovirais usados estão listados na tabela de equipamentos/materiais)
- Incubar durante 5 min e adicionar a mistura de 106 μL no tubo pré-aliquotado contendo 3 μg de vector retroviral. Misture e incube em RT por 30 min. Adicione toda essa mistura gota a gota a cada poço das células da fênix.
- Dia 3: No dia seguinte à transfecção, remova o meio das células da fênix e adicione 2 mL de meio DMEM completo fresco. No mesmo dia, semeie queratinócitos humanos primários em placas de 6 poços a uma densidade de 75.000 células por poço. Manter os queratinócitos em meio livre de soro de queratinócitos (KCSFM) com antibióticos (caneta/estreptococos).
nota: Foram adquiridos queratinócitos humanos primários. As células podem ser compradas de vários fornecedores (listados na tabela Materiais).
- Dia 4: Colha o meio das células da fênix transfectadas, que agora contêm partículas virais. Passe o meio por um filtro de 0,45 μm usando uma seringa (para remover quaisquer células de fênix contaminantes) e coloque 2 mL nos queratinócitos (plaqueados a 75.000 células/poço no dia anterior). Adicione brometo de hexadimetrina (5 μg/mL) ao meio para ajudar a mediar o processo de infecção. Os títulos virais são ~ 1 x 107 TU / mL.
- Gire as placas de 6 poços em uma centrífuga a 200 x g por 1 hora em RT. Após a centrifugação, remova o meio contendo vírus e lave as células uma vez com 1x PBS antes de adicionar KCSFM.
- Dia 5: Infecte o mesmo lote de queratinócitos novamente como em 1.4, usando 2 mL de meio filtrado contendo brometo de hexadimetrina (5 μg / mL). Gire-o a 200 x g por 1 hora em RT para remover a mídia contendo vírus e lave com 1x PBS e adicione KCSFM.
nota: Selecione os queratinócitos usando um medicamento se houver um marcador selecionável no vetor retroviral e expanda para uso em análises posteriores ou aplicações, como culturas organotípicas.