Ensaio de formação de colônias de queratinócitos: um ensaio in vitro para avaliar a capacidade dos queratinócitos de se transformarem em colônias

Resumo

Fonte: Morris, R. J. et al. Isolamento de queratinócitos epidérmicos de camundongos e sua cultura clonogênica in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, realizamos um ensaio clonogênico de queratinócitos colhidos de camundongos adultos para determinar a capacidade de células individuais de proliferar e formar colônias. Esta técnica de colheita de queratinócitos é útil para estudar outros aspectos a jusante da carcinogênese química cutânea e promoção do tumor.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Colheita e Semeadura de Queratinócitos Primários

1. Eutanasiar quatro a cinco camundongos fêmeas adultos por inalação de CO₂ de acordo com os padrões aprovados para biotérios/IACUC. No entanto, este protocolo também pode ser usado para camundongos fêmeas / machos únicos.
   1. Corte aproximadamente 9 cm² do pelo dorsal com um cortador elétrico de animais e coloque todos os camundongos cortados em um frasco de 500 mL com ....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,4% de azul de tripano 1x em solução salina a 0,9%	Tecnologias de Vida Gibco	Rolamento 15250-061
Barra de agitação magnética de 1,5 polegadas com anel de pivô	Bel-Art, Wayne	371101128	Em frasco de 2 onças Nalgene
Pipetas descartáveis de 10 mL	Falcão BD	357551
Balão de cultura de 150 cm2 (T-150)	Corning	430825
Frasco de 2 onças de Nalgene	Thermo Fisher Científico	2118-0002	60 mL
Solução de tripsina a 2,5% 10x	Tecnologias de Vida Gibco	15090-046
Tubo de conículo estéril de 50 mL	Falcão BD	352098
Filtro de células, estéril de 70 μm	Material de laboratório BD Discovery	Rolamento 352350
Colágeno Bovino Tipo I, 30 mg	BD Biociências	354231
Água destilada Milli-Q			Feito fresco; água de osmose reversa destilada duas vezes
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x, livre de Ca2+ e Mg2+	Tecnologias de Vida Gibco	14190-144	estéril
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	ATCC	30-2002
Soro fetal bovino (FBS)	Hyclone Científico Thermo Fisher		SH 300070.03
Gentamicina 50 mg/10mL	Tecnologias de Vida Gibco	15750-060
Lâminas de aço inoxidável estéreis nº 22	BD Bard-Parker	371222
Alças de bisturi nº 4	Instrumentos de Pesquisa Biomédica	26-1200	Em um copo com 70% de etanol
Uma tesoura	Instrumentos de Pesquisa Biomédica	25-1050	Em um copo com 70% de etanol
Um par de pinças de curativo de polegar	Militex	6-Abr	Em um copo com 70% de etanol
Placas de Petri de plástico estéril quadradas	Falcão BD	351112
Fibroblastos 3T3 de camundongo suíço	ATCC	CCL-92	Usado dentro de 10 passagens
Williams E Médio	Tecnologias de Vida Gibco	Rolamento 12551-032
SMEM: meio essencial mínimo livre de Ca2+ e Mg2+ para cultura em suspensão	Tecnologias de Vida Gibco	11380-037