Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Colheita e Semeadura de Queratinócitos Primários
- Eutanasiar quatro a cinco camundongos fêmeas adultos por inalação de CO2 de acordo com os padrões aprovados para biotérios/IACUC. No entanto, este protocolo também pode ser usado para camundongos fêmeas / machos únicos.
- Corte aproximadamente 9 cm2 do pelo dorsal com um cortador elétrico de animais e coloque todos os camundongos cortados em um frasco de 500 mL com solução anti-séptica de iodopovidona suficiente (não esfregue) para cobri-los por 1-2 min. Agite bem o frasco para cobrir a solução anti-séptica sobre os camundongos uniformemente.
- Despeje a solução e enxágue com água limpa até que o líquido saia limpo. Repita a mesma lavagem anti-séptica seguida de um enxágue com água. Após a lavagem antisséptica com solução de iodo, embeber todos os camundongos em etanol a 70% por 5-10 min.
NOTA: Camundongos com pêlo claro (por exemplo, BALB/c) reterão uma leve cor amarelada das lavagens de iodo anti-séptico, enquanto camundongos mais escuros (por exemplo, C57BL/6) não. Notavelmente, a viabilidade celular ou o crescimento da cultura não são afetados devido à cor amarela.
- Remova cuidadosamente a pele dorsal cortada usando uma pinça de polegar e uma tesoura em uma capa de fluxo laminar. Coloque a pele dorsal excisada em um tubo cônico cheio de PBS / 2x gentamicina. Evite usar pele lateral ventral para evitar a contaminação das células mamárias na cultura.
- Usando uma pinça autoclavada e um bisturi, coloque uma pele dorsal de cada vez, com o lado peludo voltado para baixo, em uma placa de Petri fina. Comece a raspar todo o tecido subcutâneo, incluindo a gordura do lado ventral do tecido da pele, até que fique semitranslúcido. Tente remover o máximo de vestígios de tecido subcutâneo sem rasgar a pele (parte do folículo piloso). Além disso, não raspe por muito tempo e evite o ressecamento da pele.
- Mantenha a pele raspada em solução de PBS até que todas as outras peles restantes sejam processadas. Em seguida, usando um bisturi, corte as cascas em tiras de 0,5 cm x 1-1,5 cm e coloque o lado peludo para cima em uma placa de Petri estéril.
- Pipetar cuidadosamente 20 mL de solução de PBS/2x Gentamicina misturada com tripsina (0,25%) em uma placa de Petri de plástico de 100 mm x 20 mm. Usando uma pinça estéril, transfira as peles e flutue-as com o lado peludo para cima na superfície da solução de tripsina por 2 h em uma incubadora a 32 °C.
NOTA: O tempo e a temperatura de tripsinização são cruciais para um bom rendimento de queratinócitos primários altamente cultiváveis. Embora outros métodos possam fornecer bons rendimentos de células viáveis, a capacidade de cultivo dos queratinócitos tem sido menos satisfatória.
- Durante este tempo de incubação de 2 h, cubra os pratos com revestimento de colagénio e coloque-os a 37 °C durante 1 h (ver passo 1.1.2). Para ensaios clonogênicos, as placas de Petri de 60 mm são revestidas 24 h antes da coleta de queratinócitos para permitir que a camada alimentadora irradiada de 3T3 se fixe ao fundo e se espalhe uniformemente.
nota: O revestimento de placas de cultura para cultura clonogênica é muito importante para a fixação adequada, formação de colônias e crescimento/proliferação final de queratinócitos epidérmicos de camundongos.
- Etapa de raspagem epidérmica: Organize uma placa de Petri quadrada de plástico estéril e crie uma superfície com uma inclinação de 30° para uma raspagem epidérmica adequada com 15 mL de meio de colheita (ver Tabela 1). Remova cuidadosamente uma tira de pele flutuante da solução de tripsina com uma pinça curva. Em seguida, com uma nova lâmina de bisturi, raspe a epiderme e os cabelos no meio.
- Não use força excessiva, mas use força suficiente para raspar a epiderme ou afetar a viabilidade celular.
- Durante a raspagem da epiderme, mantenha a lâmina perpendicular à peça de pele. Se a lâmina estiver inclinada em direção ao movimento da lâmina, há mais chances de rasgar a pele. Se a lâmina estiver inclinada para longe do movimento da lâmina, há mais chances de remoção incompleta da epiderme.
- Despeje cuidadosamente o meio de colheita contendo células epidérmicas raspadas em um frasco estéril de 60 mL (autoclavável e reutilizável) com uma barra de agitação magnética de 1,5 polegada. Enxágue a placa de Petri com um meio de colheita adicional para coletar as células epidérmicas restantes e leve o volume final para 30 mL. Use um agitador magnético e mexa a 100 rpm por 20 min em temperatura ambiente. Este processo removerá as células epidérmicas presas dos cabelos.
- Coloque um filtro de células estéril de 70 μm no topo de um tubo cônico de 50 mL. O filtro de células se encaixa em cima de um tubo cônico de 50 mL.
- Coloque o frasco dentro de uma capa de biossegurança. Remova a barra de agitação e despeje o conteúdo no filtro do filtro conectado a um tubo cônico de 50 mL. Coe os cabelos indesejados e as folhas de estrato córneo.
- Pressione os cabelos junto com os materiais do estrato córneo dentro do filtro e manipule-os para liberar as células ciliadas presas. Use 5 mL de meio de colheita para permitir que as células presas restantes se liberem e fluam para o tubo. Traga o volume total para 50 mL em um tubo cônico.
- Tampe o tubo cônico de 50 mL com filtrado de células e centrifugue a 160 x g por 7 min a 4 ° C. Em seguida, aspirar o sobrenadante e adicionar 5 ml de meio de colheita. Finalmente, ressuspenda o pellet celular triturando suavemente ~ 20x com uma pipeta de 5 mL.
- Nesta etapa, mantenha as células em uma caixa de gelo para evitar qualquer agregação. Em seguida, adicione 25 mL de meio de colheita e triture novamente (20-25x).
- Para garantir uma contagem precisa de queratinócitos nesta etapa, pegue 1 mL de suspensão celular e adicione 19 mL de meio de colheita. Agora, a diluição celular é de 1:20 em um tubo cônico de 50 mL. Se os queratinócitos forem colhidos de um único camundongo, ajuste o volume da suspensão celular. Por exemplo, em vez de 30 mL, use 15 mL e faça uma diluição de 1:10 para contar as células.
- Pipetar 0,5 mL de células diluídas do tubo cônico de 50 mL (diluição 1:20) e transferir para um tubo de microcentrífuga autoclavado de 1,5 mL. Remova 0,2 mL (200 μL) de mistura celular para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione um volume igual (200 μL) de solução de azul de tripano a 0,4%. Misture suavemente esta solução 3x e transfira as células para um hemocitômetro para contagem de queratinócitos nucleados.
- Marque todas as células azuis escuras positivas para azul de tripano como células mortas não viáveis e marque pequenas células douradas e rosadas como células viáveis. Assim, o rendimento final de queratinócitos por camundongo deve ser de cerca de 30 milhões de células viáveis.
- Centrifugue o tubo cônico original de 50 mL (da etapa 1.8) por 7 min a 160 x g a 4 °C. Nesta etapa, ressuspenda as células no meio desejado e faça a diluição necessária para semear as células.
- Para cultura em massa, semear 2 a 4 milhões de células de ouro viáveis em cada placa de Petri de 35 mm em meio de cultura celular (meio do tipo KGM + suplementos para culturas de monocamada) (ver Tabela 1). Para um ensaio clonogênico (formação de colônias), semeie 1.000 células por placa de Petri de 60 mm em camadas alimentadoras de camundongo suíço 3T3 irradiadas com raios-X com revestimento de colágeno e meio E de Willia modificado com suplementos e soro.
- Use um total de 2 a 4 mL de meio para placas de Petri de 35 mm e 60 mm, respectivamente. Além disso, formule o meio DMEM e Williams E obtido da ATCC com níveis reduzidos de bicarbonato de sódio para uso a 5% de CO2.
- Cultive as células de cultura (em massa ou clonogênicas) a 32 °C, 95% de umidade com 5% de CO2. Mude a mídia um dia após a semeadura inicial para cultura de massa e, em seguida, 3x por semana. No entanto, para ensaios clonais, a primeira mudança de meio é 2 dias após a semeadura celular e 3x por semana a partir de então.
- Para cultura clonal, cultive células em intervalos de duas e quatro semanas. Após a conclusão das culturas clonais (2 ou 4 semanas), aspirar o meio. Fixe as colônias em formalina tamponada a 10% durante a noite em temperatura ambiente e core com rodamina B a 0,5% em água de autoclave por 1 h. Em seguida, remova a mancha de rodamina B com uma pipeta da borda dos pratos.
- Lave a louça em água fria autoclavada até que a louça fique limpa. Coloque os pratos inclinados na tampa dos pratos e deixe-os secar para a contagem final das colônias. Notavelmente, ao realizar o ensaio de cultura clonogênica, nunca pipete <1 mL de células. Se as células estiverem concentradas, dilua em série a concentração celular.
| Soluções e Mídia | Comentários |
| Soluções de colheita | |
| 2,5% de tripsina (5 mL) | |
| PBS de Dulbecco (500 mL) | |
| Gentamicina (2 mL) | |
| PBS com 2x gentamicina (45 mL) | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 2x gentamicina | |
| Solução de tripsina | |
| Soluções de cultura celular | |
| Solução de revestimento de louça de col-fibronectina pura: | |
| 1 M HEPES (1 mL) | |
| 116 mM CaCl2 (1 mL) | |
| Albumina sérica bovina 1,0 mg/mL (10 mL) | |
| Meio de cultura celular (100 mL) | |
| Fibronectina (1 mg) | |
| Colágeno Purecol (1 mL) | |
| Solução de congelamento de células | |
| DMSO (2 mL) | |
| DMEM com 10% de BCS e caneta-estreptococos | |
| Meio de colheita | Precisa ficar sem cálcio |
| 2x gentamicina (1 mL) | |
| FBS (50 ml) | |
| SMEM (500 mL) | |
| Mídia E de Williams com alto teor de cálcio com: | |
| EGF (5 μg/mL) 1 mL | |
| Glutamina 14,5 mL | |
| Hidrocortisona (1 mg/mL) 0,5 mL | |
| Insulina 1 mL | |
| Linoácido-BSA (0,1 mg / mL) 0,5 mL | |
| Aminoácidos MEM Ess 4 mL | |
| MEM Vitaminas 5 mL | |
| Penicilina-estreptomicina 5 mL | |
| Transferrina (5mg/mL) 1 mL | |
| Vit A (1 mg/1.000 μL) 57,5 μL | |
| Vit E 1 mg/mL (4°C) 3,5 μL | |
| Vit D2 (10 mg/mL) 50 μL | |
| Meio de crescimento completo de fibroblastos 3T3 (CGM) | |
| BCS (100 mL) | |
| DMEM (900 mL) | |
| Penicilina-estreptomicina (10 mL) | |
| KGM | O meio usado para cultura em massa é um meio de cálcio reduzido |
| Morris 2 médio com os mesmos suplementos que o E de Williams | Uma variante reduzida de cálcio de Williams E com suplementos |
Tabela 1: Receitas de solução e mídia.
