Transgênese baseada em vetor miniCoopR: uma técnica para rastrear genes indutores de melanoma em modelo de tumor de peixe-zebra

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Triagem para modificadores de início de melanoma

1. Crie clones de entrada intermediária do Gateway por PCR, amplificando o quadro de leitura aberto de comprimento total de genes de interesse (GOI) e recombinando em pDONR 221 usando BP clonase II (Invitrogen). Use a tecnologia Multisite Gateway (Invitrogen) para recombinar p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA e miniCoopR para colocar genes de interesse sob o promotor mitfa no vetor miniCoopR (Figura 1A).
2. Injete 25 picogramas de cada clone junto com 25 picogramas de mRNA de transposase Tol2 em Tg(mitfa:BRAFV600E) de uma célula; pág. 53 (lf); embriões de peixe-zebra triplamente homozigotos mitfa (lf) conforme descrito anteriormente. Incubar os embriões injetados a 28,5 °C. Remover quaisquer embriões mortos a 24 hpf.
3. Selecione animais transgênicos com melanócitos resgatados a 72 hpf, colocando a placa de Petri contendo embriões injetados em um microscópio de dissecação sob luz incidente contra um fundo branco (Figura 1A).
4. Transfira os animais para tanques de 3 L no viveiro da instalação de peixe-zebra a 4 dpf.
5. Aos 2 meses, selecionar os animais com pelo menos uma área de resgate de melanócitos maior que 4 mm² (Figura 1A). Existe uma forte correlação entre o grau de resgate de melanócitos em 72 hpf e o grau de resgate de melanócitos em 2 meses. Quando embriões com resgate de melanócitos são colhidos a 72 hpf, a maioria deles (~80%) terá pelo menos uma área de resgate de melanócitos maior que 4^mm2 em 2 meses.
6. Rastreie semanalmente os animais selecionados quanto à presença de tumores (Figura 1B). Existe uma forte correlação entre as alterações histopatológicas e morfológicas. A transição de benigna para maligna é reconhecida como uma mudança morfológica quando as lesões se elevam da superfície do animal. Isole animais portadores de tumor para estudo.
7. Desenhe curvas de sobrevida livre de melanoma com a idade em semanas na abscissa e a porcentagem de sobrevida livre de melanoma na ordenada. Animais com melanócitos que expressam um gene de interesse são comparados a animais controle que expressam EGFP (proteína fluorescente verde aprimorada) em melanócitos (Figura 1C). O início médio do tumor para animais injetados com miniCoopR-EGFP é de aproximadamente 18 semanas. Determine se as duas curvas são estatisticamente diferentes usando um teste de classificação logarítmica.

Figura 1. Triagem de modificadores de início de melanoma usando o ensaio miniCoopR. A) Esquema do ensaio miniCoopR. Embrião com melanócitos resgatados (ponta de seta) contendo o vetor miniCoopR e o gene de interesse. Barra de escala = 250 μM. Adulto com resgatede melanócitos 2 maiores que 4 mm (ponta de seta). Barra de escala = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP resgatou peixe-zebra com um tumor amelanótico e pigmentado (pontas de setas). C) Curva de sobrevida livre de melanoma representativa comparando tumores que expressam o oncogene SETDB1 e um gene controle EGFP (p = 9,4×10-7, log-rank χ2).