Coloração de anticorpos de melanócitos de escamas: uma técnica para detectar fatores de transcrição expressos em melanócitos associados a escamas dorsais de modelos de peixe-zebra

Neste artigo

Resumo

Fonte: Sharanya Iyengar et al. Triagem de modificadores de melanoma usando um modelo de tumor autóctone de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2012)

Este vídeo descreve o método de coloração de anticorpos para detectar a expressão de fatores de transcrição em melanócitos associados à escama dorsal de modelos de peixe-zebra. Essa técnica de imunocoloração ajuda a identificar especificamente o fator de transfecção indutor de melanócitos-A no peixe-zebra transgênico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Coloração de anticorpos de melanócitos de escamas

Fazer o tampão PO₄ com 80 mL 0,1M Na₂HPO₄ e 20 mL 0,1M NaH₂PO₄. Certifique-se de que o pH seja 7,3. Faça 2x tampão fixo contendo 8,0g de sacarose, 0,15 mL 0,2M CaCl₂ e 90 mL 0,2M PO₄ tampão, pH 7,3. Se necessário, ajustar o pH a 7,3 com NaOH ou HCl e, em seguida, completar o volume até 100 ml com tampão PO₄.
Pesar até 300 mg de PFA sólido e adicionar a um tubo de microcentrífuga. Adicionar 5 mM de NaOH a um volume igual a 4,5 x massa, em mg, de PFA (por exemplo, 450 ul 5 mM de NaOH a 100 mg de PFA). Aquecer a 60-70 °C com agitação ocasional até que o PFA se dissolva. Reduza as partículas restantes e recupere 20% do sobrenadante PFA. Torne-o sempre fresco.
Prepare a solução de fixação contendo 1x tampão fixo e 4% de PFA.
Anestesiar os peixes em 0,17 mg/ml de tricaína.
Usando luz incidente sob um microscópio de dissecação, arranque as escamas dorsais usando pinças afiadas de ponta fina, tomando cuidado para não danificar a metade da escama contendo melanócitos (Figura 1A). Coloque as escamas diretamente da pinça em 1 mL de solução de fixação e incube em temperatura ambiente, enquanto gira, por ≥ 2 horas. Transfira o peixe para a água dos peixes e monitore o peixe para confirmar a recuperação bem-sucedida.
Para branquear melanócitos pigmentados, lave as escamas fixas em PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 vezes por 5 min em temperatura ambiente. Adicione 1 ml de solução de alvejante recém-feita contendo 0,4 mL de KOH a 10% e 0,15 mL de 30% de H₂O₂ em 5 mL com dH₂O. Coloque parafilme ou travas de tampa para evitar que o gás estoure os tubos. Continue descolorindo até que o pigmento desapareça (10 min é típico) (Figura 1B, C). Lave em PBST quatro vezes por 5 min em temperatura ambiente.
Bloqueie por pelo menos 30 min em solução em bloco composta por 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg/mL BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN₃ e 2% soro de cordeiro. Deixe de fora o NaN₃ se estiver desenvolvendo com reação HRP.
Incubar com anticorpo primário em solução em bloco durante a noite à temperatura ambiente. Você precisa ter pelo menos 400 μL de solução sobre as amostras para mantê-las submersas.
Lave a balança 3 vezes por 30 min em PBST em temperatura ambiente.
Incubar com anticorpo secundário de 2 horas a uma noite em solução em bloco à temperatura ambiente.
Manchar por 10 min com PBST + 0,1 μM DAPI.
Lave 3 vezes por 5 min com PBST.
Monte as escamas em uma lâmina de vidro em uma gota de vectashield de modo que o lado côncavo da balança fique voltado para baixo em direção à lâmina e coloque uma lamínula de vidro sobre elas. Sele as bordas da lâmina com esmalte transparente e observe as lâminas sob um microscópio de fluorescência (Figura 1D, E, F, G).

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Resultados

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Figura 1. Coloração de anticorpos de melanócitos de escamas. A) Escamas sendo arrancadas de um peixe-zebra miniCoopR-EGFP anestesiado. B) Escama não branqueada com melanócitos pigmentados e C) escama branqueada de peixe-zebra miniCoopR-EGFP. Barra de escala = 100 μM. Escala não branqueada corada com um anticorpo D)...