Ensaio de transplante subcutâneo: um método para transplantar células de melanoma de um doador para um modelo receptor de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Iyengar, S. et al. Triagem de modificadores de melanoma usando um modelo de tumor autóctone de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2012)

Este vídeo descreve o método de transplante de células tumorais do modelo de peixe-zebra doador portador de melanoma para um receptor imunocomprometido Casper zebrafish. Ajuda a visualizar o enxerto e a proliferação do tumor no peixe receptor.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Ensaio de Transplante

1. Prepare o peixe Casper receptor de 2-3 meses irradiando com 25 Gy de irradiação gama um dia antes do transplante. Deixe o peixe se recuperar na água dos peixes.
2. Eutanasiar um peixe portador de tumor de acordo com as diretrizes institucionais. Especificamente, um peixe é colocado em um prato com 0,6 mg / mL de tricaína até que o movimento das guelras pare.
3. Corte o tumor e coloque-o em uma placa de Petri com filtro de aproximadamente 5 mL esterilizado 0,9x PBS com 5% de FBS. Corte o tumor em cubos com uma navalha enquanto estiver em solução.
4. Trabalhando em temperatura ambiente, triturar com uma pipeta P1000 para obter células únicas. Completar o volume para 25 mL com filtro esterilizado 0,9x PBS com 5% de FBS.
5. Filtre através de filtro de malha de 40 μM.
6. Gire em uma centrífuga de mesa Eppendorf 5810R a 1.500 rpm (453 rcf) por 10 min.
7. Remova o sobrenadante e faça a suspensão celular até a concentração aproximadamente desejada (suponha 10⁷ células para um tumor de 100 mm³).
8. Calcule o número exato de células usando um hemocitômetro e dilua a suspensão celular de modo que o volume final da injeção seja de aproximadamente 5 μL. Por exemplo, se 50.000 células forem injetadas, a suspensão celular deve ser diluída até uma concentração final de 10.000 células/μL. Agite o tubo contendo a suspensão celular a cada poucos minutos para evitar a aglomeração das células.
9. Lave uma seringa Hamilton de calibre 26s (ponta chanfrada) 701 N 10 μL 2-3 vezes com etanol 100% e 0.9x PBS. Carregue a seringa com 5 μL da suspensão celular.
10. Anestesiar os peixes receptores irradiados em tricaína 0,17 mg/mL. Coloque o peixe de lado em um Kimwipe úmido (Figura 1A).
11. Estabilize o peixe com uma mão e insira a agulha com o chanfro voltado para cima em um ângulo de 45° no flanco do peixe acima da cavidade peritoneal, a meio caminho entre o limite posterior do rombencéfalo e a borda anterior da barbatana dorsal. Pressione suavemente o êmbolo (Figura 1B).
12. Permita que os peixes se recuperem em água doce e observe os peixes diariamente quanto ao enxerto de tumor (Figura 1C). Se o enxerto ocorreu, o crescimento contínuo e o desenvolvimento da doença também podem ser observados.

Resultados

Figura 1. Transplante de células de melanoma. A) Peixe-zebra Casper não injetado. Barra de escala = 500 μM. B) Local de transplante subcutâneo (cabeça de seta) em um receptor de Casper irradiado imediatamente após a injeção com 50.000 células de melanoma. Barra de escala = 200 μM. C) Receptor de Casper irra...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes de recombinação de gateway	Invitrogen
miniCoopR
casper Peixe-zebra
Seringa 701N 10 μl	Hamilton / Fisher	14-824
Filtro de 40 μM	Falcão BD / Pescador	Rolamento 352340
FBS	Invitrogen	26140079