1. Preparação de meios e reagentes
- Preparação de 200x de caldo de ácido L-ascórbico 2-fosfato
- Dissolva 29 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato por 5 ml de solução de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) e filtre através de um filtro de membrana de 0,22 μm. Conservar em alíquotas estéreis de 0,25 ml a -20 °C.
- Adicionar 0,25 mL de alíquota de 200x estoque de ácido L-ascórbico 2-fosfato a cada 50 mL de meio fibroblasto (DMEM com 1% de L-glutamina e 10% de soro fetal bovino) no dia necessário, para uma concentração final de 0,1 mM de ácido L-ascórbico 2-fosfato.
- Preparação de meios de crescimento de queratinócitos
- O isolamento e a cultura de queratinócitos primários de carcinoma espinocelular (CEC) foram descritos anteriormente. A preparação de meios de crescimento de queratinócitos também é descrita nele.
- Resumidamente, prepare a mídia da seguinte forma:
300 mL de DMEM e 100 mL de F-12 de Ham suplementados com 10% de FBS
0,4 mg/mL de hidrocortisona
5 mg/mL de insulina
10 ng/mL EGF
5 mg/mL de transferrina
8,4 ng/mL de toxina da cólera
13 ng/mL de liotironina
1x solução de penicilina-estreptomicina
2. Construção in vitro de matriz nativa derivada de fibroblastos em meio suplementado com ácido L-ascórbico 2-fosfato
- Semear 200.000 fibroblastos por poço em placas de 6 poços (20.000 células/cm2) em meio de fibroblastos suplementado com ácido L-ascórbico 2-fosfato. Realimente a cada 2-3 dias com 2-5 mL de meio. (Nota: A frequência e o volume de realimentação podem ser ajustados para atender às necessidades individuais de diferentes células.)
- Uma espessa camada de células embutidas na matriz extracelular se formará ao final de 6 semanas, visível a olho nu (Figura 1). Para liberar essa camada da placa de cultura de tecidos, raspe suavemente a circunferência da matriz com uma ponta de micropipeta de 1 mL e, em seguida, empurre as bordas da matriz em direção ao centro do poço. Essa camada de células e matriz (matriz nativa) deve ser facilmente destacável da superfície da placa e agora flutuar no meio. Espalhe a matriz nativa na mídia para evitar que ela se dobre.
- Deixe a matriz nativa flutuar e remodelar por 5 dias, trocando de mídia a cada 2-3 dias. Devido à resistência à tração e remodelação intrínseca dentro da matriz, a matriz se contrairá drasticamente e ficará reduzida a uma matriz nativa menor, mas mais espessa, pronta para ser utilizada para ensaio de invasão.
3. Ensaio de invasão com queratinócitos de CEC tumoral
- Pegue a matriz nativa suavemente com uma pinça romba e transfira para uma rede de nylon. Uma vez na rede de nylon, espalhe a matriz suavemente para ficar o mais plana possível usando uma ponta de micropipeta de 1 mL e uma pinça romba.
- Prepare os cilindros clonais estéreis espalhando uma pequena quantidade de vaselina estéril em uma extremidade.
- Coloque os cilindros clonais na matriz nativa, com o lado da vaselina voltado para baixo. Isso é para garantir uma vedação firme entre a matriz nativa e os anéis clonais.
- Adicione células cSCC aos cilindros clonais (250.000 células em 100 μl de meio de crescimento de queratinócitos).
- Remova os cilindros clonais após 6 horas, quando as células cSCC se estabeleceram na matriz nativa.
- Levante a rede de nylon com a matriz nativa e as células cSCC para a interface ar-líquido no suporte de malha de arame de aço inoxidável dobrado.
- Adicione meios de crescimento de queratinócitos suplementados com ácido ascórbico até que o nível do meio toque o fundo da matriz nativa.
- Troque o meio a cada 2-3 dias e colha aos 7 e 14 dias, após a semeadura das células cSCC.
