Este artigo irá detalhar o protocolo para medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivendo por citometria de fluxo.
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Artigo de método
Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Calpaínas são onipresentes intracelular, cálcio-sensíveis, cisteína proteases neutras
Protocolo
Prepare Reagentes
Nota: Todos os PBS contém Ca 2 + e Mg 2 +
- Reagente de detecção
Adicionar 20Hm 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-Leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensão de células exigirá reagente de detecção 2 ml. - Paraformaldeído 1% (células fixas)
Diluir solução stock 4% paraformaldeído em PBS à temperatura ambiente. Paraformaldeído 1mL alíquota de 1% a cada tubo FACS. Três tubos FACS são necessários para cada condição experimental (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 precisará de 9 tubos FACS) - PD150606 (inibidor da ca....
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Discussão
A atividade de calpaína em células 32Dkit fixa e vivendo foi determinado neste protocolo de vídeo. Tratamento da linhagem de células com o inibidor de calpaína PD150606 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. Além disso, o tratamento com o inibidor MEK1 PD98059 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. ERK é um ativador principal de calpaína-2 3. Estes resultados sugerem que calpaína-2 é a atividade predominante nas células 32Dkit. Trabalhos em curso em nosso laborató.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Suportada por concessões do Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society do Canadá e da Fundação Linfoma do Canadá.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldeído | Invitrogen | Dissolva 4 g de paraformaldeído em 100 mL de PBS. Em capela, aqueça a amostra com agitação até ficar transparente. Deixe esfriar, depois armazene a 4°C | |
| PD150606 | Invitrogen | Use PD150606 recém-reconstituído para inibição máxima da calpaína. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| AlignFlow, AlignFlow mais esferas fluorescentes, tubos FACS | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | O sobrenadante de células WEHI-3 é utilizado como fonte de IL-3 nestes experimentos. Cada coleta de sobrenadante de WEHI-3 é titulada para determinar a concentração ótima utilizada para o crescimento de células 32Dkit. |
Referências
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.
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Reimpressões e permissões
