Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na operação de um sistema integrado de força atômica-microscópio óptico de imagem para a estimulação mecânica de células vivas em cultura. Um protocolo passo a passo é apresentado. Um representante conjunto de dados que mostra a resposta de células vivas ao estímulo mecânico é apresentado.
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Artigo de método
Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para entender o mecanismo pelo qual as células vivas sentido forças mecânicas, e como eles reagem e se adaptam ao seu ambiente, uma nova tecnologia capaz de investigar o comportamento de células em sub-nível celular com resolução espacial e temporal alta foi desenvolvido. Assim, um microscópio de força atômica (AFM) foi integrado com um total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) e velocidade de rotação do disco (FSD) microscopia confocal. O sistema integrado é amplamente aplicável em uma ampla gama de estudos de dinâmica molecular em qualquer células aderentes ao vivo, permitindo que imagens ópticas direta de respostas das células ao estímulo mecânico em tempo real. Reorganização significativa dos filamentos de actina e aderências focal foi mostrado devido à estimulação mecânica local na superfície da célula apical, que induziu alterações na estrutura celular em todo o corpo da célula. Estas técnicas inovadoras irá fornecer novas informações para a compreensão de reestruturação de células vivas e dinâmicas em resposta à força mecânica. Um protocolo detalhado e um conjunto de dados representativos que mostram a resposta de células vivas ao estímulo mecânico são apresentados.
Protocolo
1. Visão Geral do Sistema Integrado de Microscopia
O sistema de microscópio que é usado para estes estudos tem sido descrito em detalhe 1. Resumidamente, um microscópio invertido Olympus IX-81 com TIRF anexo (Olympus, Center Valley, PA) é combinado com CSU-22 Yokogawa cabeça de leitura (Yokogawa Electric Inc, Japão). A Bioscope SZ microscópio de força atômica (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) é montado em cima do microscópio óptico invertido, e todo o sistema é colocado em cima de uma mesa de grade de pesquisa óptico (Newport, Irvine, CA).
A montagem confocal compostas a partir da verificação....
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Discussão
Aderências citoesqueleto 10/07 e 16/11 focal são estruturas dinâmicas que montar, dispersar e virar as células migram ou responder a força mecânica 17. Eles têm funções importantes na regulação do crescimento celular, sobrevivência e expressão gênica. Sabendo sua distribuição e dinâmicas específicas fornece uma melhor compreensão de como as células se comunicam com a matriz e entre si.
Este sistema novo microscópio é amplamente aplicável em uma ampla gama de .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Vinculina-GFP plasmídeo foi um presente de Kenneth Yamada, National Institutes of Health, Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial, Bethesda, Maryland, e actina-MRFP plasmídeo foi um presente de Michael Davidson, Universidade Estadual da Flórida, Tallahassee, Florida.
Este trabalho foi financiado pela NSF Prémio Carreira # 0747334 e AHA-Nacional SDG # 0835205N a Andreea Trache.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ponta de AFM | Novascan Technologies, Inc. | Esfera de borossilicato de 2 mícrons, 0,01 N/m, superfície com biotina | |
| avidina | Sigma-Aldrich | A9275 | 1 mg/mL em DPBS |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Kit de transfeção Amaxa para Células Musculares Lisas | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Placas MatTek com fundo de vidro | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Placas estéreis de 60 mm Falcon com lamínula de fundo de vidro nº 1.5 |
Referências
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Tay....
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Reimpressões e permissões
